Este protocolo permite resolver el esqueleto periódico de membrana en el segmento inicial del axón de las neuronas cultivadas. Al examinar la localización de las proteínas, se puede obtener información sobre la función en el esqueleto periódico de la membrana. La principal ventaja de esta técnica es su robustez y facilidad de uso.
La microscopía de iluminación estructurada es capaz de resolver el esqueleto periódico de la membrana y la preparación de la muestra es fácil y directa. Cualquier persona con experiencia previa en microscopía de fluorescencia puede implementar fácilmente esta técnica. Este protocolo está diseñado para maximizar la relación señal-ruido durante la preparación de muestras y la obtención de imágenes.
Para comenzar, fije las neuronas usando 4% de paraformaldehído durante 12 minutos a temperatura ambiente. Lave el resbalón de la cubierta una vez en BSA al 0,2% en solución tampón de fosfato e incube durante 10 minutos en una solución al 1% de Tritón X en PBS a temperatura ambiente. Lave el resbalón de la cubierta con BSA en solución tampón de fosfato, diluya los anticuerpos anti anquirina G usando BSA en una solución tampón de fosfato en una proporción de uno a 200.
Agregue la solución de anticuerpos al deslizamiento de la cubierta e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Lave las células una vez en solución tampón de fosfato BSA una vez en 0.1% Triton X en solución tampón de fosfato y una vez en solución tampón de fosfato. Diluir Fluoro 4 marcado, agregar más anticuerpos secundarios en la solución tampón de fosfato BSA y agregar al resbalón de la cubierta.
Lave las células una vez en la solución tampón de fosfato BSA una vez en 0.1% Triton X en solución tampón de fosfato, luego una vez en solución tampón de fosfato. Prepare una solución micromolar de Ferodin marcado en una solución tampón de fosfato y agréguela a las células. Lave las células una vez en la solución tampón de fosfato de albúmina sérica bovina una vez en solución tampón de fosfato al 0,1% en 0,1% en solución tampón de fosfato, luego una vez en solución tampón de fosfato.
Para montar el resbalón de la cubierta en un portaobjetos de vidrio, aplique una gota de medios de montaje en un portaobjetos, sumerja el resbalón de la cubierta en agua desionizada y tóquelo con una toalla de papel suave para eliminar el exceso de agua. Coloque el resbalón de la cubierta en el portaobjetos de vidrio e incube a temperatura ambiente durante 24 horas. Si es posible, consulte con el personal de la instalación de microscopía antes de obtener imágenes y use una calculadora de aceite de inmersión para seleccionar el aceite de inmersión adecuado para la muestra.
Una vez que las muestras estén listas, asegúrese de que los resbalones de la cubierta estén limpios y libres de cualquier residuo limpiándolos con una punta de algodón sumergida en agua o etanol. Coloque la muestra en un microscopio 3D-SIM y encuentre la célula para capturar la imagen. Ajuste la potencia de las líneas láser relevantes.
Y los tiempos de exposición para maximizar la relación señal/ruido sin blanquear significativamente la muestra. Establezca los límites superior e inferior de la muestra en la dimensión Z y proceda a adquirir una pila. Ejecute el algoritmo de reconstrucción en la pila para obtener una reconstrucción súper resuelta.
Verifique las reconstrucciones de los artefactos conocidos y, si es necesario, ajuste los parámetros para corregirlos. Compare la reconstrucción de la SIM con una imagen de campo amplio para observar mejoras en la resolución. Al realizar microscopía de iluminación estructurada multicolor, utilice el algoritmo de alineación para alinear los diferentes canales correctamente, una vez que esté lista una reconstrucción satisfactoria.
Los anillos de actina en el esqueleto periódico de membrana tienen una apariencia periódica distintiva. Cree una imagen de proyección de máxima intensidad en el software de análisis de imágenes utilizando todos los planos focales donde los anillos de actina son visibles. En la imagen de proyección de máxima intensidad, dibuje una línea perpendicular a través de anillos adyacentes visibles y registre la intensidad de fluorescencia junto con la función de perfil de trazado de línea del software.
Para calcular la distancia media entre picos, anote los máximos locales en el perfil de línea y mida la distancia entre picos de intensidad fluorescente adyacentes individuales. Para evaluar la colocalización de diferentes proteínas con anillos de actina en el esqueleto periódico de la membrana, ejecute un procedimiento de análisis de colocalización en reconstrucciones SIM de actina y la proteína candidata. Dibuje manualmente una selección para definir el segmento inicial del axón como una región de interés, para el complemento de colocalización fácil en la plataforma de software, y ejecute el análisis para calcular el coeficiente de correlación de Pearson para la colocalización.
Durante el análisis de imágenes SIM, las reconstrucciones de las pilas de imágenes mostraron una clara periodicidad de los anillos de actina. Se utilizó un anticuerpo anti anquirina G para visualizar la anquirina G.La colocalización de los anillos de anquirina G y actina se probó en el segmento inicial del axón utilizando un procedimiento de análisis de colocalización para calcular el coeficiente de correlación de Pearson. El coeficiente de correlación de Pearson para la colocalización de la anquirina G y la fluorescencia de los anillos de actina fue de 0,36 más o menos 0,03.
Es esencial utilizar el aceite de inmersión adecuado y ajustar la potencia del láser y el tiempo de exposición para que las líneas de la red sean visibles. Una vez que se determina que la proteína es parte del esqueleto periódico de la membrana, su función puede ser investigada y establecida en el mantenimiento del esqueleto periódico de la membrana. Por ejemplo, se pueden analizar los efectos de derribar la proteína en los anillos de actina.
El desarrollo de técnicas de microscopía de súper resolución es la razón por la que sabemos que el segmento inicial del axón contiene un esqueleto periódico de membrana que comprende anillos de actina, espectro y anquirina. SIM ha permitido a los investigadores visualizar fácilmente los componentes periódicos del esqueleto de la membrana y observar los anillos de actina en las células vivas.
