يستخدم هذا البروتوكول نهجا جديدا لأخذ عينات من المشيم من فراشة الفقس للتحليل الجيني. قد يكون مفيدا بشكل خاص عندما تكون تقنيات أخذ عينات الأنسجة الأخرى غير عملية أو غير متوفرة أو غير مسموح بها. هذا البروتوكول له تكلفة إجمالية منخفضة نسبيا باستخدام سهولة الحصول على الإمدادات ويستهدف المواد العضوية المتبقية التي تلغي الحاجة إلى التقاط الكائنات الحية أو التلاعب بها مؤقتا وربما إلحاق الضرر بها للحصول على عينات جينية.
البروتوكول العام واضح ومباشر وسهل التعلم ، ولكنه يتطلب براعة واهتماما صارما بالتفاصيل ، وتحديدا لتحديد موقع العينات المستهدفة الصغيرة جدا وتحديدها وإزالتها بنجاح لتجنب التلوث المتبادل بين أحداث جمع العينات. ابدأ بمراجعة وجمع القائمة الكاملة للمستلزمات المتعلقة بالمجموعة المطلوبة بعناية. إذا حدث جمع العينات في مواقع متعددة أو بواسطة أفراد أو فرق متعددة ، فقم بجمع وتنظيم جميع الإمدادات اللازمة في وحدات منفصلة قابلة للنشر.
نقل الإمدادات إلى علماء المجتمع أو غيرهم من الموظفين المسؤولين عن الجمع الميداني. إذا لم يكن الموظفون محليين ، فقم بتعبئة الإمدادات بعناية في صندوق شحن منفصل من الورق المقوى مع ملصق شحن كامل وقم بشحنها. عند استلام مستلزمات التجميع بما في ذلك صندوق معالجة التجميع ، راجع بعناية قائمة التوريد المصفحة وقم بإجراء جرد كامل.
قم بإخطار قائد المشروع في حالة فقدان أي إمدادات. املأ أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر ب 180 ميكرولتر من محلول التحلل. قم بتطبيق ملصق معرف فريد مطبوع مسبقا على كل أنبوب طرد مركزي دقيق وضع جميع الأنابيب في صندوق تخزين أنبوب الطرد المركزي الدقيق المكون من 64 بئرا.
قم بتأمين الغطاء بإحكام بعد التحميل. تأكد من أن جميع المعدات الرقمية مشحونة بالكامل وأن أي بطاريات احتياطية معبأة. املأ جزئيا مبردا صغيرا بالثلج للتخزين الميداني والنقل المحلي للعينات التي تم جمعها.
قم بتعبئة جميع مستلزمات التجميع في صندوق معالجة التجميع أو حاوية قوية مماثلة مقاومة للعوامل الجوية للنقل الآمن والتخزين الموحد. مراجعة بروتوكول جمع العينات الجينية غير المدمرة والتفاصيل قبل التوجه إلى الميدان. عند الوصول إلى الموقع الميداني ، استخدم قلم رصاص أو قلم لجميع الأحوال الجوية لتسجيل الوقت من اليوم والتاريخ والاسم العام للممتلكات واسم أو وصف موقع الحقل المحدد وقراءة GPS إن وجدت والاسم الكامل وأدوار جميع الأفراد الموجودين في دفتر الملاحظات الميداني المقاوم للعوامل الجوية.
حدد موطنا مناسبا لوجود نبات مضيف يرقات للفراشة المستهدفة الخاصة بالأنواع. باستخدام هاتف ذكي أو كاميرا ، التقط صورا مفصلة لجميع المواقع الميدانية ومواقع جمع العينات والنباتات المضيفة والمعلومات الأخرى ذات الصلة. استخدم الهواتف الذكية أو الكاميرات الأخرى التي تسجل إحداثيات GPS.
ابحث بشكل شامل في جميع أجزاء النبات المضيف لليرقات مثل الأوراق أو براعم الزهور أو الزهور أو الفاكهة النامية المعروفة بأنها مختارة من قبل الفراشات البالغة التي تفترض البويضات للبيض المفرغ. بالنسبة لمعظم Lycaenidae، ابحث عن بيض أبيض مفرغ به ثقب مميز في المنتصف يشبه الدونات التي خرجت منها يرقة حديث الولادة. ابحث عن البيض غير المفقس الذي يكون أغمق في اللون ، وغالبا ما يكون أخضر أو مزرقا ، وسيكون سليما تماما بدون ثقب في المنتصف.
بمجرد العثور على بيضة فقس ، ارتد قفازات النتريل. باستخدام ملقط معقم ومدبب ، أمسك البيضة المفرغة واسحبها برفق من النبات المضيف وضعها مباشرة في أنبوب طرد مركزي دقيق المسمى مملوء مسبقا بمخزن مؤقت للتحلل. وبالمثل ، يمكن استخدام عينات الأنسجة الأخرى ومعالجتها.
تأكد من أن جميع المواد التي تم جمعها مغمورة بالكامل في مخزن التحلل داخل كل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. اضغط على الجزء السفلي من الأنبوب على سطح صلب لإعادة غمر أي عينات إذا لزم الأمر. عند جمع عينة جديدة ، تخلص من قفازات النتريل المستخدمة واستبدلها بزوج نظيف.
بعد كل جمع للبيض ، قم بتنظيف أطراف الملقط بعناية عن طريق غمسها أو غمرها في قنينة من الإيثانول بنسبة 95٪ من زجاجة ضغط أو باستخدام مناديل كحولية. اجمع ما لا يقل عن خمس عينات لكل رقعة نبات مضيف لكل موقع ، كل عينة تحتوي على بيضة واحدة إلى 20 بيضة ، بهدف الحصول على أكثر من 50 بيضة إجمالا في الموقع إذا كان ذلك متاحا. اجمع من بيضة إلى 20 بيضة مفرغة من نباتات متعددة في نفس رقعة المضيف في أنبوب طرد مركزي دقيق واحد وأغلق الغطاء بإحكام.
بالنسبة لأنواع الفراشات التي تستخدم أنواعا عشبية أو خشبية مضيفة أكبر ، اجمع بيضا متعددا من مواقع مختلفة على نفس النبات إذا كانت بقع المضيف محدودة. في دفتر الملاحظات الميداني المقاوم للعوامل الجوية، قم بتسجيل تسمية المعرف الفريد المعين مع نوع العينة والعدد التقريبي للبيض المفقس ومعلومات المجموعة. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق المغلق مع عينة حطام البيض مرة أخرى في صندوق تخزين أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المكون من 64 بئرا.
حافظ على صندوق التخزين في مبرد به ثلج أثناء وجودك في الحقل. ضع جميع مستلزمات التجميع الأخرى في صندوق معالجة التجميع للتخزين والنقل الآمن والموحد بين المواقع. من بين هذه العينات ال 160 ، تم استخراج الحمض النووي بنجاح من 88 بمتوسط تركيز 1.67 نانوجرام لكل ميكرولتر وكان أعلى عائد للحمض النووي 26.8 نانوجرام لكل ميكرولتر.
وأكدت تركيزات الحمض النووي حسب نوع الأنسجة أن العينات التي تحتوي على بقايا بيضة واحدة تحتوي على علبة بيضة واحدة فقط وأن العينات التي تحتوي على حالات بويضات متعددة تحتوي على حالتين على الأقل يتراوح عدد الحالات بين حالتين و 20 حالة، بمتوسط 5.3 لكل عينة. تم إرسال مواد لجمع ما يصل إلى 563 عينة إلى ثمانية علماء في مجال الحفظ والمجتمع من تسع ولايات عبر نطاق الأنواع في شرق أمريكا الشمالية. تم إرسال المواد على مدار ثلاثة أشهر خلال عام 2021 قبل أوقات الذروة المحلية للطيران.
تم استلام ما مجموعه 160 عينة من أنسجة قزحية كاليفيليس. من الأهمية بمكان تقليل التلوث المتبادل بين العينات ، والتأكد من غمر العينة التي تم جمعها بالكامل في مخزن التحلل ، وتسجيل ملصق المعرف الفريد وبيانات المجموعة لكل عينة بدقة. مكن هذا البروتوكول من الانتشار والاستخدام على نطاق واسع من قبل علماء المجتمع لأخذ عينات غير مدمرة من المجموعات الموجودة من فراشة نادرة للمساعدة في إجراء تحليل واسع النطاق للبنية الجينية.
