Ce protocole utilise une nouvelle approche d’échantillonnage du chorion du papillon éclos ovi pour l’analyse génétique. Il peut être particulièrement utile lorsque d’autres techniques d’échantillonnage de tissus ne sont pas pratiques, indisponibles ou non autorisées. Ce protocole a un coût global relativement faible en utilisant des fournitures faciles à acquérir et cible la matière organique résiduelle qui élimine le besoin de capturer ou de manipuler temporairement et potentiellement nuire aux organismes vivants pour acquérir des échantillons génétiques.
Le protocole global est simple et facile à apprendre, mais exige de la dextérité et une attention stricte aux détails, en particulier pour localiser, identifier et retirer avec succès de très petits échantillons cibles afin d’éviter la contamination croisée entre les événements de prélèvement d’échantillons. Commencez par examiner attentivement et rassembler la liste complète des fournitures liées à la collecte nécessaires. Si le prélèvement d’échantillons a lieu à plusieurs endroits ou par plusieurs personnes ou équipes, rassembler et organiser toutes les fournitures nécessaires dans des unités déployables distinctes.
Transporter les fournitures aux scientifiques de la communauté ou à d’autres membres du personnel responsables de la collecte sur le terrain. Si le personnel n’est pas local, emballez soigneusement les fournitures dans une boîte d’expédition en carton séparée avec une étiquette d’expédition complète et expédiez-les. À la réception des fournitures de collecte, y compris la boîte d’articles de collecte, examinez attentivement la liste des fournitures plastifiées et effectuez un inventaire complet.
Avisez le chef de projet s’il manque des fournitures. Préremplissez les tubes microcentrifugeuses de 1,5 millilitre avec 180 microlitres de tampon de lyse. Apposez une étiquette d’identification unique préimprimée sur chaque tube de microcentrifugeuse et placez tous les tubes dans la boîte de stockage de tubes de microcentrifugeuses à 64 puits.
Fixez fermement le couvercle après le chargement. Assurez-vous que tous les équipements numériques sont complètement chargés et que toutes les batteries de rechange sont emballées. Remplissez partiellement une petite glacière avec de la glace pour l’entreposage sur le terrain et le transport local des échantillons recueillis.
Emballez toutes les fournitures de collecte dans la boîte d’articles de collecte ou dans un conteneur similaire robuste et résistant aux intempéries pour un transport sûr et un stockage consolidé. Passez en revue le protocole de collecte d’échantillons génétiques non destructifs et les détails avant de vous rendre sur le terrain. À votre arrivée sur le terrain, utilisez un crayon ou un stylo toutes saisons pour noter l’heure de la journée, la date, le nom général de la propriété, le nom ou la description de l’emplacement du site sur le terrain, la lecture GPS si disponible, ainsi que le nom complet et les rôles de toutes les personnes présentes dans le carnet de notes de terrain résistant aux intempéries.
Trouver un habitat convenable pour la présence d’une plante hôte larvaire sur le papillon cible propre à l’espèce. À l’aide d’un téléphone intelligent ou d’un appareil photo, prenez des photos détaillées de tous les sites sur le terrain, des lieux de prélèvement d’échantillons, des plantes hôtes et d’autres informations pertinentes. Utilisez des smartphones ou d’autres appareils photo qui enregistrent les coordonnées GPS.
Effectuez une recherche exhaustive de toutes les parties larvaires de la plante hôte, telles que les feuilles, les boutons floraux, les fleurs ou les fruits en développement connus pour être sélectionnés par des papillons femelles adultes qui posent des ovules pour les œufs éclos. Pour la plupart des Lycaenidae, recherchez des œufs éclos blancs avec un trou distinct au centre ressemblant à un beignet d’où la larve nouveau-née a émergé. Recherchez des œufs non éclos de couleur plus foncée, souvent verts ou bleuâtres, et qui seront complètement intacts sans trou au milieu.
Une fois qu’un œuf éclos est localisé, portez des gants en nitrile. À l’aide de pinces stériles et pointues, saisir et retirer doucement l’œuf éclos de la plante hôte et le placer directement dans un tube microcentrifuge étiqueté prérempli de tampon de lyse. De même, d’autres échantillons de tissus peuvent être utilisés et traités.
Assurez-vous que tout le matériel collecté est complètement immergé dans le tampon de lyse dans chaque tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Tapotez le fond du tube sur une surface dure pour réimmerger les échantillons si nécessaire. Lors du prélèvement d’un nouvel échantillon, jetez les gants en nitrile usagés et remplacez-les par une paire propre.
Après chaque collecte d’œufs, nettoyez soigneusement les pointes des forceps en les trempant ou en les aspergeant dans un flacon d’éthanol à 95 % provenant d’un flacon pressé ou en utilisant des lingettes imbibées d’alcool. Prélever au moins cinq échantillons par parcelle de plante hôte par site, chaque échantillon contenant un à 20 œufs, en visant un total de plus de 50 œufs à un endroit si disponible. Recueillir un à 20 œufs éclos de plusieurs plantes dans la même parcelle hôte dans un seul tube microcentrifuge et fermer fermement le couvercle.
Pour les espèces de papillons utilisant de plus grandes espèces hôtes herbacées ou ligneuses, prélever plusieurs œufs à différents endroits sur la même plante si les parcelles hôtes sont limitées. Dans le carnet de notes de terrain résistant aux intempéries, notez l’étiquette d’identification unique attribuée ainsi que le type d’échantillon, le nombre approximatif d’œufs éclos et les renseignements sur le prélèvement. Replacez le tube de microcentrifugation fermé contenant l’échantillon de débris d’œufs dans la boîte de stockage de microcentrifugeuses à 64 puits.
Conservez la boîte de rangement dans une glacière avec de la glace sur le terrain. Placez toutes les autres fournitures de collecte dans la boîte d’articles de collecte pour un entreposage et un transport sûrs et consolidés entre les sites. Sur ces 160 échantillons, l’ADN a été extrait avec succès de 88 avec une concentration moyenne de 1,67 nanogramme par microlitre et le rendement en ADN le plus élevé était de 26,8 nanogrammes par microlitre.
Les concentrations d’ADN par type de tissu ont confirmé que les échantillons contenant un seul débris d’œuf n’avaient qu’un seul cas d’œuf et que les échantillons contenant plusieurs cas d’œufs avaient au moins deux cas, le nombre de cas allant de deux à 20, soit une moyenne de 5,3 par échantillon. Le matériel nécessaire à la collecte de 563 échantillons a été envoyé à huit scientifiques de la conservation et des communautés de neuf États de l’aire de répartition de l’espèce dans l’est de l’Amérique du Nord. Les documents ont été envoyés pendant trois mois en 2021 avant les heures de pointe de vol locales.
Au total, 160 échantillons de tissus d’iris de Calephelis ont été reçus. Il est essentiel de minimiser la contamination croisée entre les échantillons, de s’assurer que l’échantillon prélevé est complètement immergé dans le tampon de lyse et d’enregistrer avec précision l’étiquette d’identification unique et les données de prélèvement pour chaque échantillon. Ce protocole a permis aux scientifiques de la communauté de se déployer et de les utiliser à grande échelle pour échantillonner de manière non destructive les populations existantes d’un papillon rare afin d’aider à effectuer une analyse de la structure génétique à l’échelle de la gamme.
