Este protocolo usa uma nova abordagem de amostragem do córion de ovi borboleta eclodida para análise genética. Pode ser particularmente útil quando outras técnicas de amostragem de tecidos são impraticáveis, indisponíveis ou não permitidas. Este protocolo tem um custo global relativamente baixo usando suprimentos fáceis de adquirir e tem como alvo material orgânico residual que elimina a necessidade de capturar ou manipular temporariamente e potencialmente prejudicar os organismos vivos para adquirir amostras genéticas.
O protocolo geral é simples e fácil de aprender, mas requer destreza e atenção rigorosa aos detalhes, especificamente para localizar, identificar e remover com sucesso amostras alvo muito pequenas para evitar a contaminação cruzada entre os eventos de coleta de amostras. Comece revisando e reunindo cuidadosamente a lista completa de suprimentos relacionados à coleta necessários. Se a coleta de amostras ocorrer em vários locais ou por vários indivíduos ou equipes, reúna e organize todos os suprimentos necessários em unidades implantáveis separadas.
Suprimentos de transporte para cientistas comunitários ou outro pessoal responsável pela coleta de campo. Se o pessoal não for local, embale cuidadosamente os suprimentos em uma caixa de remessa de papelão separada com uma etiqueta de remessa completa e envie-os. Após o recebimento dos suprimentos de coleta, incluindo a caixa de coleta de equipamentos, revise cuidadosamente a lista de suprimentos laminados e realize um inventário completo.
Notifique o líder do projeto se algum suprimento estiver faltando. Pré-encha tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro com 180 microlitros de tampão de lise. Aplique uma etiqueta de identificação exclusiva pré-impressa em cada tubo de microcentrífuga e coloque todos os tubos na caixa de armazenamento de tubos de microcentrífuga de 64 poços.
Prenda firmemente a tampa após o carregamento. Certifique-se de que todos os equipamentos digitais estejam totalmente carregados e que todas as baterias sobressalentes estejam embaladas. Encha parcialmente um pequeno refrigerador com gelo para armazenamento em campo e transporte local das amostras coletadas.
Embale todos os suprimentos de coleta na caixa de equipamento de coleta ou em um recipiente resistente e resistente semelhante à prova de intempéries para transporte seguro e armazenamento consolidado. Revise o protocolo de coleta de amostras genéticas não destrutivas e detalhe antes de ir para o campo. Ao chegar ao local de campo, use um lápis ou uma caneta meteorológica para registrar a hora do dia, a data, o nome geral da propriedade, o nome ou a descrição do local específico do local do campo, a leitura por GPS, se disponível, e o nome completo e as funções de todos os indivíduos presentes no caderno de campo à prova de intempéries.
Localize um habitat adequado para a presença de uma planta hospedeira larval para a borboleta-alvo específica da espécie. Usando um smartphone ou câmera, tire fotografias detalhadas de todos os locais de campo, locais de coleta de amostras, plantas hospedeiras e outras informações relevantes. Use smartphones ou outras câmeras que gravam coordenadas GPS.
Pesquise de forma abrangente todas as partes da planta hospedeira larval, como folhas, botões florais, flores ou frutos em desenvolvimento conhecidos por serem selecionados por borboletas fêmeas adultas que postulam óvulos para ovos chocados. Para a maioria dos Lycaenidae, procure ovos brancos eclodidos com um buraco distinto no centro semelhante a um donut do qual a larva recém-nascida emergiu. Procure ovos não eclodidos que sejam de cor mais escura, muitas vezes verdes ou azulados, e que estejam completamente intactos sem um buraco no meio.
Uma vez que um ovo chocado é localizado, use luvas nitrílicas. Usando pinças estéreis e pontiagudas, pegue e puxe suavemente o ovo chocado da planta hospedeira e coloque-o diretamente em um tubo de microcentrífuga rotulado pré-preenchido com tampão de lise. Da mesma forma, outras amostras de tecido podem ser usadas e processadas.
Certifique-se de que todo o material coletado esteja totalmente submerso no tampão de lise dentro de cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Toque na parte inferior do tubo em uma superfície dura para re-submergir todas as amostras, se necessário. Ao coletar uma nova amostra, descarte luvas de nitrilo usadas e substitua-as por um par limpo.
Após cada coleta de ovos, limpe cuidadosamente as pontas da pinça mergulhando-as ou mergulhando-as em um frasco de etanol a 95% de uma garrafa de esprema ou usando lenços umedecidos. Coletar pelo menos cinco amostras por mancha de planta hospedeira por local, cada amostra contendo de um a 20 ovos, visando mais de 50 ovos no total em um local, se disponível. Colete de um a 20 ovos chocados de várias plantas no mesmo local hospedeiro em um único tubo de microcentrífuga e feche firmemente a tampa.
Para espécies de borboletas que utilizam espécies hospedeiras herbáceas ou lenhosas maiores, colete vários ovos de diferentes locais na mesma planta se as manchas hospedeiras forem limitadas. No caderno de campo à prova de intempéries, registre a etiqueta de identificação exclusiva atribuída, juntamente com o tipo de amostra, o número aproximado de ovos chocados e as informações de coleta. Coloque o tubo de microcentrífuga fechado com a amostra de detritos de ovos de volta na caixa de armazenamento de microcentrífuga de 64 poços.
Mantenha a caixa de armazenamento em um refrigerador com gelo enquanto estiver no campo. Coloque todos os outros suprimentos de coleta na caixa de coleta para armazenamento e transporte seguros e consolidados entre os locais. Dessas 160 amostras, o DNA foi extraído com sucesso de 88 com uma concentração média de 1,67 nanogramas por microlitro e o maior rendimento de DNA foi de 26,8 nanogramas por microlitro.
As concentrações de DNA por tipo de tecido confirmaram que as amostras contendo um único detrito de ovo tinham apenas um caso de ovo e as amostras contendo vários casos de ovos tinham pelo menos dois casos, com o número de casos variando de dois a 20, em média de 5,3 por amostra. Materiais para coletar até 563 amostras foram enviados para oito cientistas de conservação e comunitários de nove estados em toda a gama de espécies no leste da América do Norte. Os materiais foram enviados ao longo de três meses durante 2021, antes dos horários de pico de voo locais.
Um total de 160 amostras de tecido de Calephelis iris foram recebidas. É crucial minimizar a contaminação cruzada entre as amostras, garantir que a amostra coletada esteja totalmente submersa no buffer de lise e registrar com precisão o rótulo de identificação exclusivo e os dados de coleta para cada amostra. Este protocolo permitiu uma ampla implantação e uso por cientistas comunitários para amostragem não destrutiva de populações existentes de uma borboleta rara para ajudar a conduzir uma ampla análise de estrutura genética.
