Este protocolo utiliza un enfoque novedoso de muestreo del corion de ovi mariposa eclosionado para el análisis genético. Puede ser particularmente útil cuando otras técnicas de muestreo de tejidos no son prácticas, no están disponibles o no están permitidas. Este protocolo tiene un costo total relativamente bajo utilizando suministros fáciles de adquirir y apunta al material orgánico residual que elimina la necesidad de capturar o manipular temporalmente y potencialmente dañar organismos vivos para adquirir muestras genéticas.
El protocolo general es sencillo y fácil de aprender, pero requiere destreza y estricta atención al detalle, específicamente para localizar, identificar y eliminar con éxito muestras objetivo muy pequeñas para evitar la contaminación cruzada entre los eventos de recolección de muestras. Comience por revisar cuidadosamente y reunir la lista completa de suministros relacionados con la recolección necesarios. Si la recolección de muestras ocurre en múltiples ubicaciones o por múltiples individuos o equipos, reúna y organice todos los suministros necesarios en unidades desplegables separadas.
Transportar suministros a científicos comunitarios u otro personal responsable de la recolección de campo. Si el personal no es local, empaque cuidadosamente los suministros en una caja de cartón separada con una etiqueta de envío completa y envíelos. Al recibir los suministros de recolección, incluida la caja de aparejos de recolección, revise cuidadosamente la lista de suministros laminados y realice un inventario completo.
Notifique al líder del proyecto si falta algún suministro. Prellene los tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros con 180 microlitros de tampón de lisis. Aplique una etiqueta de identificación única preimpresa a cada tubo de microcentrífuga y coloque todos los tubos en la caja de almacenamiento de tubos de microcentrífuga de 64 pocillos.
Asegure firmemente la tapa después de la carga. Asegúrese de que todos los equipos digitales estén completamente cargados y que las baterías de repuesto estén empacadas. Llene parcialmente una hielera pequeña con hielo para el almacenamiento en el campo y el transporte local de las muestras recolectadas.
Empaque todos los suministros de recolección en la caja de aparejos de recolección o en un contenedor resistente a la intemperie similar para un transporte seguro y almacenamiento consolidado. Revise el protocolo de recolección de muestras genéticas no destructivas y detalle antes de dirigirse al campo. Al llegar al sitio de campo, use un lápiz o un bolígrafo para todo clima para registrar la hora del día, la fecha, el nombre general de la propiedad, el nombre o la descripción de la ubicación específica del sitio del campo, la lectura del GPS si está disponible y el nombre completo y los roles de todas las personas presentes en el cuaderno de campo resistente a la intemperie.
Localice un hábitat adecuado para la presencia de una planta huésped larval para la mariposa objetivo específica de la especie. Usando un teléfono inteligente o una cámara, tome fotografías detalladas de todos los sitios de campo, ubicaciones de recolección de muestras, plantas hospedadoras y otra información relevante. Use teléfonos inteligentes u otras cámaras que registren coordenadas GPS.
Busque exhaustivamente todas las partes larvales de la planta huésped, como hojas, capullos florales, flores o frutas en desarrollo que se sabe que son seleccionadas por las mariposas hembras adultas que postulan óvulos para huevos eclosionados. Para la mayoría de los Lycaenidae, busque huevos de eclosión blanca con un agujero distintivo en el centro que se asemeje a una rosquilla de la que emergió la larva neonata. Busque huevos sin eclosionar que sean de color más oscuro, a menudo verde o azulado, y que estén completamente intactos sin un agujero en el medio.
Una vez que se localice un huevo eclosionado, use guantes de nitrilo. Usando pinzas estériles y puntiagudas, agarre y saque suavemente el huevo eclosionado de la planta huésped y colóquelo directamente en un tubo de microcentrífuga etiquetado precargado con tampón de lisis. Del mismo modo, se pueden usar y procesar otras muestras de tejido.
Asegúrese de que todo el material recolectado esté completamente sumergido en el tampón de lisis dentro de cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Golpee la parte inferior del tubo sobre una superficie dura para volver a sumergir las muestras si es necesario. Al recolectar una nueva muestra, deseche los guantes de nitrilo usados y reemplácelos con un par limpio.
Después de cada recolección de huevos, limpie cuidadosamente las puntas de los fórceps sumergiéndolos o rociándolos en un frasco de etanol al 95% de una botella de compresión o usando toallitas con alcohol. Recoja al menos cinco muestras por parche de planta huésped por sitio, cada muestra contiene de uno a 20 huevos, con el objetivo de obtener más de 50 huevos en total en un lugar si está disponible. Recoja de uno a 20 huevos eclosionados de varias plantas en el mismo parche huésped en un solo tubo de microcentrífuga y cierre firmemente la tapa.
Para las especies de mariposas que utilizan especies herbáceas o leñosas hospedadoras más grandes, recolecte múltiples huevos de diferentes lugares en la misma planta si los parches del huésped son limitados. En el cuaderno de campo resistente a la intemperie, registre la etiqueta de identificación única asignada junto con el tipo de muestra, el número aproximado de huevos eclosionados y la información de recolección. Vuelva a colocar el tubo cerrado de microcentrífuga con muestras de restos de huevo en la caja de almacenamiento de microcentrífugas de 64 pocillos.
Mantenga la caja de almacenamiento en una hielera con hielo mientras está en el campo. Coloque todos los demás suministros de recolección en la caja de aparejos de recolección para un almacenamiento y transporte seguros y consolidados entre sitios. De estas 160 muestras, el ADN se extrajo con éxito de 88 con una concentración promedio de 1,67 nanogramos por microlitro y el mayor rendimiento de ADN fue de 26,8 nanogramos por microlitro.
Las concentraciones de ADN por tipo de tejido confirmaron que las muestras que contenían un solo residuo de huevo tenían solo una caja de huevos y las muestras que contenían múltiples cajas de huevos tenían al menos dos casos con un número de casos que oscilaba entre dos y 20, con un promedio de 5.3 por muestra. Se enviaron materiales para recolectar hasta 563 muestras a ocho científicos de conservación y comunitarios de nueve estados en todo el rango de especies en el este de América del Norte. Los materiales se enviaron durante tres meses durante 2021 antes de las horas pico de vuelo locales.
Se han recibido un total de 160 muestras de tejido de iris de Calephelis. Es crucial minimizar la contaminación cruzada entre las muestras, garantizar que la muestra recolectada esté completamente sumergida en el tampón de lisis y registrar con precisión la etiqueta de identificación única y los datos de recolección para cada muestra. Este protocolo permitió un amplio despliegue y uso por parte de científicos comunitarios para muestrear de forma no destructiva las poblaciones existentes de una mariposa rara para ayudar a realizar un análisis de estructura genética de amplio rango.
