このプロトコルは、遺伝子分析のために孵化した蝶の卵から絨毛膜をサンプリングするという新しいアプローチを使用しています。これは、他の組織サンプリング技術が実用的でない、利用できない、または許可されていない場合に特に有用であり得る。このプロトコルは、入手が容易な供給品を使用して全体的なコストが比較的低く、残留有機物質を標的とするため、遺伝子サンプルを取得するために一時的に捕獲または操作し、生物に害を及ぼす可能性があります。
全体的なプロトコルは簡単で習得が容易ですが、サンプル収集イベント間の相互汚染を回避するために、非常に小さなターゲットサンプルを正常に特定、識別、除去するには、器用さと細部への厳密な注意が必要です。まず、必要な収集関連の備品の完全なリストを注意深く確認して収集します。サンプル収集が複数の場所で、または複数の個人またはチームによって行われる場合は、必要なすべての消耗品を収集し、個別の展開可能なユニットに整理します。
地域の科学者またはフィールド収集を担当するその他の担当者に物資を輸送します。担当者が現地にいない場合は、完全な配送ラベルが付いた別の段ボール配送ボックスに消耗品を慎重に梱包して発送します。収集タックルボックスを含む収集用品を受け取ったら、ラミネート供給リストを注意深く確認し、完全な在庫を作成します。
不足している消耗品がある場合は、プロジェクトリーダーに通知します。1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに180マイクロリットルの溶解バッファーをプレフィルします。事前に印刷された一意のIDラベルを各マイクロ遠心チューブに貼り付け、すべてのチューブを64ウェルマイクロ遠心チューブ保管ボックスに入れます。
装填後は蓋をしっかりと固定してください。すべてのデジタル機器が完全に充電され、予備のバッテリーが梱包されていることを確認してください。収集されたサンプルのフィールド保管とローカル輸送のために、小さなクーラーを部分的に氷で満たします。
安全な輸送と統合保管のために、すべての収集用品を収集タックルボックスまたは同様の頑丈な耐候性容器に梱包します。現場に向かう前に、非破壊遺伝子サンプル収集プロトコルと詳細を確認してください。フィールドサイトに到着したら、鉛筆または全天候型ペンを使用して、時刻、日付、全体的なプロパティ名、特定のフィールドサイトの場所の名前または説明、GPS読み取り値(利用可能な場合)、および存在するすべての個人のフルネームと役割を記録します耐候性フィールドノートブック。
種固有の標的蝶に対する幼虫宿主植物の存在に適した生息地を見つける。スマートフォンやカメラを使って、現場、検体採取場所、宿主工場などを詳細に撮影します。GPS座標を記録するスマートフォンやその他のカメラを使用してください。
卵子をポジショニングする成体の雌蝶が選択することが知られている葉、花芽、花、発育中の果実など、すべての幼虫宿主植物の部分を包括的に検索して、孵化した卵を探します。ほとんどのLycaenidaeでは、新生児の幼虫が出てきたドーナツに似た中央に明確な穴がある白い孵化した卵を探します。色が濃く、多くの場合緑色または青みがかっていて、中央に穴が開いていない完全に無傷の孵化していない卵を探します。
孵化した卵が見つかったら、ニトリル手袋を着用してください。滅菌済みの先のとがった鉗子を使用して、孵化した卵を宿主植物からつかんでそっと引き抜き、溶解バッファーを事前に充填したラベル付きのマイクロ遠心チューブに直接入れます。同様に、他の組織試料も使用および処理することができる。
収集されたすべての材料が、各1.5ミリリットルの微量遠心チューブ内の溶解バッファーに完全に沈んでいることを確認してください。硬い表面のチューブの底を軽くたたいて、必要に応じてサンプルを再水没させます。新しいサンプルを収集するときは、使用済みのニトリル手袋を廃棄し、きれいなペアと交換してください。
各卵の収集後、スクイーズボトルから95%エタノールのバイアルに浸すか、アルコールワイプを使用して、鉗子の先端を慎重に清掃します。サイトごとに宿主植物パッチごとに少なくとも5つのサンプルを収集し、各サンプルには1〜20個の卵が含まれ、利用可能な場合はその場所で合計50個以上の卵を目指します。同じ宿主パッチ内の複数の植物から1〜20個の孵化した卵を1つのマイクロ遠心チューブに集め、蓋をしっかりと閉めます。
より大きな草本または木質の宿主種を利用する蝶種の場合、宿主パッチが限られている場合は、同じ植物の異なる場所から複数の卵を収集します。耐候性フィールドノートに、割り当てられた一意のIDラベルを、サンプルの種類、孵化した卵のおおよその数、および収集情報とともに記録します。卵の破片サンプルを入れた閉じたマイクロ遠心チューブを64ウェルのマイクロ遠心機保管ボックスに戻します。
フィールドにいる間、保管ボックスを氷の入ったクーラーボックスに保管してください。他のすべての収集用品を収集タックルボックスに入れて、サイト間の安全で統合された保管と輸送を行います。これらの160サンプルのうち、88サンプルから平均濃度1.67ナノグラム/マイクロリットルでDNAを抽出することに成功し、最高のDNA収量はマイクロリットルあたり26.8ナノグラムでした。
組織型別のDNA濃度から、卵の破片を1つ含むサンプルは卵ケースが1つしかなく、複数の卵のケースを含むサンプルには少なくとも2つのケースがあり、症例数は2〜20であり、サンプルあたり平均5.3であることが確認されました。最大563のサンプルを収集するための資料が、北アメリカ東部の種の範囲にわたる9つの州の8人の保全およびコミュニティ科学者に送られました。資料は、現地のピーク飛行時間の前に2021年に3か月以上にわたって発送されました。
合計160のカレフェリス虹彩組織サンプルが受け取られました。サンプル間の相互汚染を最小限に抑え、採取したサンプルを溶解バッファーに完全に沈め、各サンプルの固有のIDラベルと収集データを正確に記録することが重要です。このプロトコルにより、コミュニティ科学者による幅広い展開と使用が可能になり、希少な蝶の現存する個体群を非破壊的にサンプリングして、幅広い遺伝子構造分析を実施できるようになりました。
