Bu protokol, genetik analiz için taranmış kelebek ovi'den koryonu örneklemek için yeni bir yaklaşım kullanır. Diğer doku örnekleme tekniklerinin pratik olmadığı, kullanılamadığı veya izin verilmediği durumlarda özellikle yararlı olabilir. Bu protokol, elde edilmesi kolay malzemeleri kullanarak nispeten düşük bir genel maliyete sahiptir ve genetik örnekler elde etmek için canlı organizmaları geçici olarak yakalama veya manipüle etme ve potansiyel olarak zarar verme ihtiyacını ortadan kaldıran artık organik materyali hedefler.
Genel protokol basit ve öğrenmesi kolaydır, ancak özellikle numune toplama olayları arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için çok küçük hedef numuneleri başarılı bir şekilde bulmak, tanımlamak ve çıkarmak için el becerisi ve detaylara sıkı dikkat gerektirir. Gerekli koleksiyonla ilgili malzemelerin tam listesini dikkatlice gözden geçirerek ve toplayarak başlayın. Örnek toplama birden fazla konumda veya birden fazla kişi ya da ekip tarafından gerçekleştiriliyorsa, gereken tüm malzemeleri ayrı konuşlandırılabilir birimlerde toplayın ve düzenleyin.
Malzemeleri topluluk bilim insanlarına veya saha toplamadan sorumlu diğer personele taşımak. Personel yerel değilse, malzemeleri eksiksiz bir nakliye etiketi ile ayrı bir karton nakliye kutusuna dikkatlice paketleyin ve gönderin. Toplama işleme kutusu da dahil olmak üzere toplama malzemeleri alındıktan sonra, lamine tedarik listesini dikkatlice gözden geçirin ve eksiksiz bir envanter yapın.
Herhangi bir malzeme eksikse proje liderini bilgilendirin. 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerini 180 mikrolitre lizis tamponu ile önceden doldurun. Her mikrosantrifüj tüpüne önceden basılmış benzersiz bir kimlik etiketi uygulayın ve tüm tüpleri 64 delikli mikrosantrifüj tüp saklama kutusuna yerleştirin.
Yükledikten sonra kapağı sıkıca sabitleyin. Tüm dijital ekipmanların tamamen şarj edildiğinden ve yedek pillerin dolu olduğundan emin olun. Sahada depolama ve toplanan örneklerin yerel olarak taşınması için küçük bir soğutucuyu kısmen buzla doldurun.
Güvenli taşıma ve konsolide depolama için tüm toplama malzemelerini toplama çantasına veya benzeri sağlam hava koşullarına dayanıklı kaba koyun. Sahaya girmeden önce tahribatsız genetik örnek toplama protokolünü ve detaylarını gözden geçirin. Saha sahasına vardıktan sonra, günün saatini, tarihini, genel mülk adını, belirli alan sitesi konumu adını veya açıklamasını, varsa GPS okumasını ve hava koşullarına dayanıklı alan defterinde bulunan tüm bireylerin tam adını ve rollerini kaydetmek için bir kalem veya tüm hava kalemi kullanın.
Larva konakçı bitkinin varlığına türe özgü hedef kelebeğe uygun bir yaşam alanı bulun. Bir akıllı telefon veya kamera kullanarak tüm saha sahalarının, numune toplama yerlerinin, ev sahibi tesislerin ve diğer ilgili bilgilerin ayrıntılı fotoğraflarını çekin. GPS koordinatlarını kaydeden akıllı telefonlar veya diğer kameralar kullanın.
Yapraklar, çiçek tomurcukları, çiçekler veya yumurtadan çıkmış yumurtalar için yumurta pozisyonlu yetişkin dişi kelebekler tarafından seçildiği bilinen gelişmekte olan meyveler gibi tüm larva konakçı bitki kısımlarını kapsamlı bir şekilde araştırın. Çoğu Lycaenidae için, merkezinde yenidoğan larvaların ortaya çıktığı bir çöreğe benzeyen belirgin bir deliğe sahip beyaz yumurtadan çıkmış yumurtaları arayın. Daha koyu renkli, genellikle yeşil veya mavimsi olan ve ortasında bir delik olmadan tamamen sağlam olacak yumurtalardan çıkmamış yumurtaları arayın.
Yumurtadan çıkan bir yumurta bulunduğunda, nitril eldiven giyin. Steril ve sivri uçlu forseps kullanarak, yumurtadan çıkmış yumurtayı konakçı bitkiden alın ve yavaşça çekin ve doğrudan lizis tamponu ile önceden doldurulmuş etiketli bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Benzer şekilde, diğer doku örnekleri kullanılabilir ve işlenebilir.
Toplanan tüm malzemelerin, her 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpü içindeki lizis tamponuna tamamen batırıldığından emin olun. Gerekirse numuneleri yeniden batırmak için tüpün tabanına sert bir yüzeye dokunun. Yeni bir numune toplarken, kullanılmış nitril eldivenleri atın ve temiz bir çiftle değiştirin.
Her yumurta toplamadan sonra, forseps uçlarını sıkma şişesinden% 95 etanol şişesine batırarak veya dökerek veya alkollü mendiller kullanarak dikkatlice temizleyin. Saha başına konakçı bitki yaması başına en az beş örnek toplayın, her örnek bir ila 20 yumurta içerir ve varsa bir yerde toplam 50'den fazla yumurta hedefleyin. Aynı konakçı yamadaki birden fazla bitkiden bir ila 20 yumurtadan çıkmış yumurtayı tek bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın ve kapağı sıkıca kapatın.
Daha büyük otsu veya odunsu konakçı türleri kullanan kelebek türleri için, konakçı yamaları sınırlıysa, aynı bitkinin farklı yerlerinden birden fazla yumurta toplayın. Hava koşullarına dayanıklı alan defterine, atanan benzersiz kimlik etiketini, numune türü, yaklaşık yumurtadan çıkan yumurta sayısı ve toplama bilgileriyle birlikte kaydedin. Kapalı mikrosantrifüj tüpünü yumurta artıkları örneği ile birlikte 64 delikli mikrosantrifüj saklama kutusuna geri yerleştirin.
Saklama kutusunu tarladayken buzlu bir soğutucuda tutun. Güvenli ve konsolide depolama ve tesisler arasında taşıma için diğer tüm toplama malzemelerini toplama çantasına yerleştirin. Bu 160 örnekten DNA, mikrolitre başına ortalama 1.67 nanogram konsantrasyonu ile 88'den başarıyla çıkarıldı ve en yüksek DNA verimi mikrolitre başına 26.8 nanogram idi.
Doku tipine göre DNA konsantrasyonları, tek bir yumurta kalıntısı içeren örneklerin sadece bir yumurta kasasına sahip olduğunu ve birden fazla yumurta vakası içeren örneklerin, vaka sayısı iki ila 20 arasında değişen ve örnek başına ortalama 5.3 olan en az iki vakaya sahip olduğunu doğruladı. 563'e kadar örnek toplamak için materyaller, Doğu Kuzey Amerika'daki türler arasındaki dokuz eyaletten sekiz koruma ve topluluk bilimcisine gönderildi. Malzemeler, yerel yoğun uçuş saatlerinden önce 2021 boyunca üç ay boyunca gönderildi.
Toplam 160 Calephelis iris doku örneği alınmıştır. Numuneler arasındaki çapraz kontaminasyonu en aza indirmek, toplanan numunenin lizis tamponuna tamamen batırılmasını sağlamak ve her numune için benzersiz kimlik etiketini ve toplama verilerini doğru bir şekilde kaydetmek çok önemlidir. Bu protokol, topluluk bilim adamları tarafından, bir dizi geniş genetik yapı analizinin yapılmasına yardımcı olmak için nadir bir kelebeğin mevcut popülasyonlarını tahribatsız bir şekilde örneklemek için geniş bir dağıtım ve kullanım sağladı.
