يعالج بروتوكولنا آثار البروتينات التنظيمية المرتبطة بالحمض النووي الريبي على التكوين الحيوي للحمض النووي الريبي الميكروي ونضجه ، مباشرة من مزارع الخلايا. يمكن تنفيذ الطريقة التي نصفها باستخدام كواشف زراعة الخلايا الشائعة وهي سريعة نسبيا. يمكن أن تكون هذه الطريقة مهمة لدراسة التأثيرات المظهرية لل microRNAs وأهدافها في أنواع مختلفة من الخلايا حقيقية النواة.
يمكن استخدام الخلايا الطبيعية أو الشبيهة بالأمراض. من المهم اختيار خطوط الخلايا القابلة للنقل ، وإجراء ضوابط نقل وتحريض كافية من أجل مراقبة التغيرات في تقارب الهدف من خلال نشاط luciferase. للبدء ، حافظ على الخلايا في DMEM ، مكمل الجلوكوز العالي في أطباق بتري 100 ملم واحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة جوية رطبة يتم التحكم فيها مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
لفصل الخلايا الملتصقة ، احتضنها بمحلول التربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. لإجراء عمليات النقل ، امزج 200 نانوغرام من الحمض النووي و 1.25 ميكرولتر من كاشف النقل في 100 ميكرولتر من وسط المزرعة وأضف خليط النقل إلى الخلايا. ثم ، احتضن الخلايا بمخاليط النقل لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية.
ثم استبدل الوسط بوسط يحتوي على 10٪ FBS واحتضنه لمدة 24 ساعة أخرى قبل إضافة المضادات الحيوية للاختيار. لنقل pFLAG-HuR و MT-pFLAG إلى HeLa، حدد الخلايا عن طريق زيادة تركيز Geneticin من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر إلى 1000 ميكروغرام لكل ملليلتر، مما يولد خطوط خلايا مستقرة. ثم ، قم بتأكيد التعبير الزائد باستخدام PCR الكمي باستخدام الاشعال المحددة ل HuR mRNA.
قم بنقل البلازميدات في خلايا HeLa-Cre مع 40 نانوغرام pTK-Renilla ، ثم pRD miR 17-92 ، وتوليد HeLa-Cre miR 17-92 ، والاختيار مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر بيوروميسين. بعد ذلك ، قم بنقل HeLa-Cre miR 17-92 مع pTK-Renilla و pmirGLO RAB1B 3'UTR أو pmirGLO 1B 3'UTR بشكل منفصل. بعد ذلك ، حدد باستخدام البنسلين والستربتومايسين ، مما أدى إلى توليد luc RAB1B و luc المخفوق.
بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا باستخدام pFLAG-HuR أو MT-PFLAG كما هو موضح سابقا. انتقل إلى زراعة الخلايا باستخدام HeLa-Cre miR 17-92 luc و HeLa-Cre miR 17-92 المخفوق و HeLa-Cre miR 17-92 HuR و HeLa-Cre miR 1792 HuR lock حتى يتم الوصول إلى ما يقرب من 80٪ من التقاء. ثم ، حث مع ميكرولتر واحد من الدوكسيسيكلين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وأيضا الحفاظ على جميع الخلايا دون الدوكسيسيكلين كضوابط لنفس الفترة.
لتحديد ومقارنة شدة التلألؤ المختلفة ، استخدم مجموعة فحص مراسل luciferase المزدوج. قبل البدء في الفحص ، قم بإذابة محاليل فحص luciferase واتركها في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج Stop و Glo عن طريق خلط 200 ميكرولتر من الركيزة في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت لفحص luciferase اثنين.
ثم امزج 10 ملليلتر من مقايسة لوسيفيراز العازلة اثنين في العنبر حقير من الركيزة فحص لوسيفيراز اثنين لإعداد المزيج ، LAR II ، ويهز جيدا. بعد ذلك ، انقل المحاليل إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي 15 ملليلتر تم تحديدها مسبقا وحمايتها من الضوء. بعد ذلك ، قم بإجراء قراءات التلألؤ باستخدام معدات مثل Synergy وقياس luciferase المعبر عنه كوحدات ضوئية نسبية ، ثم قم بتصدير النتائج إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل الإحصائي.
أداء تطبيع نشاط لوسيفيراز اليراع من قبل رينيلا السيطرة ورسم ذلك كوحدات الضوء النسبية في الرسم أثناء تكرار للمجموعات مع وبدون تحريض الدوكسيسيكلين. تم تأكيد الإفراط في التعبير عن HuR عند نقل pFLAG-HuR في خط الخلايا HeLa، BCPAP، و HEK293T، ولوحظ أن فرط التعبير عن HuR في هذه الخلايا يحفز التعبير عن miR19A. لوحظ انخفاض قوي في نشاط luciferase مع RAB1B 3'UTR عند زيادة تعبير miR19A و miR19B من pRD miR 17-92 ، مقارنة بخلايا HeLa-Cre.
لم يغير نقل pFLAG-HuR في خلايا HeLa نشاط luciferase. ومع ذلك ، فإن الإفراط في التعبير عن HuR ، إلى جانب مكملات الدوكسيسيكلين التي تحفز التعبير عن مجموعة miR 17-92 ، يقلل من نشاط luciferase. بعد التأكد من دور البروتين المرتبط بالحمض النووي الريبي في نضج الحمض النووي الريبي الميكروي، ستكون حركية الخلية وتحليل دورة الخلية مهمة لفهم التغيرات الرئيسية التي يعززها البروتين في الحمض النووي الريبي الميكروي.
