Unser Protokoll befasst sich mit den Auswirkungen regulatorischer RNA-bindender Proteine auf die microRNA-Biogenese und -Reifung direkt aus Zellkulturen. Die von uns beschriebene Methode kann mit gängigen Zellkulturreagenzien durchgeführt werden und ist relativ schnell. Diese Methode kann wichtig sein, um die phänotypischen Wirkungen von microRNAs und ihren Zielen in verschiedenen Arten von eukaryotischen Zellen zu untersuchen.
Normale oder krankheitsähnliche Zellen können verwendet werden. Es ist wichtig, Zelllinien auszuwählen, die für die Transfektion geeignet sind, und geeignete Transfektions- und Induktionskontrollen durchzuführen, um die Veränderungen der Zielaffinität durch Luciferase-Aktivität zu beobachten. Um zu beginnen, halten Sie die Zellen in DMEM, hohe Glukose Ergänzung in 100 Millimeter Petrischalen und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten, kontrollierten Atmosphäre Inkubator mit 5% Kohlendioxid.
Um adhärente Zellen abzulösen, inkubieren Sie sie mit Trypsin-EDTA-Lösung bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten. Um Transfektionen durchzuführen, mischen Sie 200 Nanogramm DNA und 1,25 Mikroliter Transfektionsreagenz in 100 Mikroliter des Kulturmediums und fügen Sie die Transfektionsmischung zu den Zellen hinzu. Dann inkubieren Sie die Zellen mit den Transfektionsmischungen für vier Stunden bei 37 Grad Celsius.
Dann ersetzen Sie das Medium durch ein Medium, das 10% FBS enthält, und inkubieren Sie für weitere 24 Stunden, bevor Sie die Antibiotika zur Auswahl hinzufügen. Um pFLAG-HuR und MT-pFLAG in HeLa zu transfizieren, selektieren Sie Zellen, indem Sie die Konzentration von Geneticin von 100 Mikrogramm pro Milliliter auf 1000 Mikrogramm pro Milliliter erhöhen, wodurch stabile Zelllinien erzeugt werden. Dann bestätigen Sie die Überexpression mit quantitativer PCR unter Verwendung spezifischer Primer für HuR-mRNA.
Transfizieren Sie die Plasmide in HeLa-Cre-Zellen mit 40 Nanogramm pTK-Renilla, dann pRD miR 17-92, erzeugen HeLa-Cre miR 17-92 und selektieren Sie mit einem Mikrogramm pro Milliliter Puromycin. Dann transfiziert HeLa-Cre miR 17-92 mit pTK-Renilla und pmirGLO RAB1B 3'UTR oder pmirGLO verschlüsselt 1B 3'UTR separat. Als nächstes wählen Sie Penicillin und Streptomycin, was zur Erzeugung von Luc RAB1B und Luc Scrambled führt.
Als nächstes transfizieren Sie die Zellen mit pFLAG-HuR oder MT-PFLAG, wie sie zuvor gezeigt haben. Fahren Sie mit der Zellkultur mit HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 verschlüsselt, HeLa-Cre miR 17-92 HuR und HeLa-Cre miR 1792 HuR Lock fort, bis etwa 80% der Konfluenz erreicht sind. Dann induzieren Sie mit einem Mikroliter Doxycyclin für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und halten Sie auch alle Zellen ohne Doxycyclin als Kontrollen für den gleichen Zeitraum.
Um verschiedene Lumineszenzintensitäten zu quantifizieren und zu vergleichen, verwenden Sie das Dual-Luciferase-Reporter-Assay-Kit. Vor Beginn des Assays Luciferase-Assay-Lösungen auftauen und bei Raumtemperatur belassen. Als nächstes bereiten Sie die Mischung Stop und Glo vor, indem Sie 200 Mikroliter des Substrats in 10 Milliliter Luciferase-Assay-Puffer zwei mischen.
Mischen Sie dann 10 Milliliter Luciferase-Assay-Puffer zwei in das bernsteinfarbene Vile des Luciferase-Assay-Substrats zwei, um die Mischung LAR II vorzubereiten, und schütteln Sie sie gut. Anschließend werden die Lösungen in 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt, die zuvor identifiziert und vor Licht geschützt wurden. Als nächstes führen Sie die Lumineszenzmessungen mit Geräten wie Synergy durch und messen die ausgedrückte Luciferase als relative Lichteinheiten und exportieren die Ergebnisse dann zur weiteren statistischen Analyse in eine Tabelle.
Führen Sie eine Normalisierung der Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität durch die Steuerung Renilla durch und zeichnen Sie diese als relative Lichteinheiten in einer Grafik auf, während Sie für Gruppen mit und ohne Doxycyclin-Induktion wiederholen. Die Überexpression von HuR bei Transfektion von pFLAG-HuR wurde in HeLa-, BCPAP- und HEK293T-Zelllinien bestätigt, und es wurde beobachtet, dass die HuR-Überexpression in diesen Zellen die Expression von miR19A stimuliert. Eine starke Verringerung der Luciferase-Aktivität wurde mit RAB1B 3'UTR bei erhöhter miR19A- und miR19B-Expression von pRD miR 17-92 im Vergleich zu HeLa-Cre-Zellen beobachtet.
Die Transfektion von pFLAG-HuR in HeLa-Zellen veränderte die Luciferase-Aktivität nicht. Die Überexpression von HuR, gekoppelt mit einer Doxycyclin-Supplementierung, die die Expression des miR-17-92-Clusters stimulierte, reduzierte jedoch die Luciferase-Aktivität weiter. Nach der Bestätigung der Rolle des RNA-bindenden Proteins bei der microRNA-Reifung werden Zellkinetik und Zellzyklusanalyse wichtig sein, um die wichtigsten Veränderungen zu verstehen, die durch das Protein in microRNAs gefördert werden.
