Nuestro protocolo aborda los efectos de las proteínas reguladoras de unión al ARN en la biogénesis y maduración del microARN, directamente de los cultivos celulares. El método que describimos se puede realizar con reactivos de cultivo celular comunes y es relativamente rápido. Este método puede ser importante para estudiar los efectos fenotípicos de los microARN y sus dianas en diferentes tipos de células eucariotas.
Se pueden usar células normales o similares a enfermedades. Es importante elegir líneas celulares susceptibles de transfección, realizar controles adecuados de transfección e inducción para observar los cambios en la afinidad objetivo a través de la actividad luciferasa. Para empezar, mantener las células en DMEM, suplemento de alta glucosa en placas de Petri de 100 milímetros e incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada y en atmósfera controlada con 5% de dióxido de carbono.
Para separar las células adherentes, incubarlas con solución de tripsina-EDTA a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos. Para realizar transfecciones, mezcle 200 nanogramos de ADN y 1,25 microlitros de reactivo de transfección en 100 microlitros del medio de cultivo y agregue la mezcla de transfección a las células. Luego, incubar las células con las mezclas de transfección durante cuatro horas a 37 grados centígrados.
Luego reemplace el medio con un medio que contenga 10% FBS e incube durante otras 24 horas antes de agregar los antibióticos para la selección. Para transfectar pFLAG-HuR y MT-pFLAG en HeLa, seleccione células aumentando la concentración de genética de 100 microgramos por mililitro a 1000 microgramos por mililitro, generando líneas celulares estables. Luego, confirme la sobreexpresión con PCR cuantitativa utilizando cebadores específicos para ARNm de HuR.
Transfecta los plásmidos en células HeLa-Cre con 40 nanogramos de pTK-Renilla, luego pRD miR 17-92, generando HeLa-Cre miR 17-92, y seleccionando con un microgramo por mililitro de puromicina. Luego, transfectó HeLa-Cre miR 17-92 con pTK-Renilla y pmirGLO RAB1B 3'UTR o pmirGLO revolvió 1B 3'UTR por separado. A continuación, seleccione el uso de penicilina y estreptomicina, lo que resulta en la generación de luc RAB1B y luc revuelto.
A continuación, transfecte las células con pFLAG-HuR o MT-PFLAG como se demostró anteriormente. Proceder al cultivo celular con HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 revuelto, HeLa-Cre miR 17-92 HuR y HeLa-Cre miR 1792 HuR lock hasta alcanzar aproximadamente el 80% de la confluencia. Luego, inducir con un microlitro de doxiciclina durante 30 minutos a 37 grados centígrados y también mantener todas las células sin doxiciclina como controles durante el mismo período.
Para cuantificar y comparar diferentes intensidades de luminiscencia, utilice el kit de ensayo de reportero de luciferasa dual. Antes de comenzar el ensayo, descongele las soluciones de ensayo de luciferasa y déjelas a temperatura ambiente. A continuación, prepare la mezcla Stop y Glo mezclando 200 microlitros del sustrato en 10 mililitros de tampón de ensayo de luciferasa dos.
Luego mezcle 10 mililitros de tampón de ensayo de luciferasa dos en el sustrato de ensayo de luciferasa ámbar vil dos para preparar la mezcla, LAR II, y agite bien. Después, transfiera las soluciones a tubos centrífugos de 15 mililitros previamente identificados y protegidos de la luz. A continuación, realice las lecturas de luminiscencia utilizando equipos como Synergy y mida la luciferasa expresada como unidades de luz relativa, y luego exporte los resultados a una hoja de cálculo para un análisis estadístico adicional.
Realizar la normalización de la actividad luciferasa luciérnaga por el control Renilla y trazarla como unidades de luz relativa en un gráfico mientras se repite para grupos con y sin inducción de doxiciclina. La sobreexpresión de HuR tras la transfección de pFLAG-HuR se confirmó en la línea celular HeLa, BCPAP y HEK293T, y se observó que la sobreexpresión de HuR en estas células estimula la expresión de miR19A. Se observó una fuerte reducción en la actividad de la luciferasa con RAB1B 3'UTR tras el aumento de la expresión de miR19A y miR19B de pRD miR 17-92, en comparación con las células HeLa-Cre.
La transfección de pFLAG-HuR en células HeLa no cambió la actividad de la luciferasa. Sin embargo, la sobreexpresión de HuR, junto con la suplementación con doxiciclina que estimula la expresión del grupo miR 17-92, redujo aún más la actividad de la luciferasa. Después de confirmar el papel de la proteína de unión al ARN en la maduración del microARN, la cinética celular y el análisis del ciclo celular serán importantes para comprender los principales cambios promovidos por la proteína en los microARN.
