Protokolümüz, düzenleyici RNA bağlayıcı proteinlerin mikroRNA biyogenezi ve olgunlaşması üzerindeki etkilerini, doğrudan hücre kültürlerinden ele almaktadır. Tanımladığımız yöntem ortak hücre kültürü reaktifleri ile gerçekleştirilebilir ve nispeten hızlıdır. Bu yöntem, mikroRNA'ların fenotipik etkilerini ve farklı ökaryotik hücre tiplerindeki hedeflerini incelemek için önemli olabilir.
Normal veya hastalık benzeri hücreler kullanılabilir. Lusiferaz aktivitesi yoluyla hedef afinitedeki değişiklikleri gözlemlemek için transfeksiyona uygun hücre hatlarının seçilmesi, yeterli transfeksiyon ve indüksiyon kontrollerinin yapılması önemlidir. Başlamak için, hücreleri DMEM'de tutun, 100 milimetre Petri kaplarında yüksek glikoz takviyesi yapın ve hücreleri% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş, kontrollü bir atmosfer inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.
Yapışkan hücreleri ayırmak için, üç ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede tripsin-EDTA çözeltisi ile inkübe edin. Transfeksiyonları gerçekleştirmek için, kültür ortamının 100 mikrolitresinde 200 nanogram DNA ve 1.25 mikrolitre transfeksiyon reaktifini karıştırın ve transfeksiyon karışımını hücrelere ekleyin. Daha sonra, hücreleri transfeksiyon karışımlarıyla 37 santigrat derecede dört saat boyunca inkübe edin.
Daha sonra ortamı% 10 FBS içeren ortamla değiştirin ve seçim için antibiyotik eklemeden önce 24 saat daha inkübe edin. pFLAG-HuR ve MT-pFLAG'i HeLa'ya aktarmak için, Geneticin konsantrasyonunu mililitre başına 100 mikrogramdan mililitre başına 1000 mikrograma çıkararak hücreleri seçin ve kararlı hücre hatları oluşturun. Daha sonra, HuR mRNA için spesifik primerler kullanarak kantitatif PCR ile aşırı ekspresyonu onaylayın.
HeLa-Cre hücrelerindeki plazmidleri 40 nanogram pTK-Renilla, daha sonra pRD miR 17-92 ile transfekte edin, HeLa-Cre miR 17-92 üretin ve mililitre puromisin başına bir mikrogram ile seçin. Daha sonra, pTK-Renilla ve pmirGLO RAB1B 3'UTR veya pmirGLO ile transfekt HeLa-Cre miR 17-92, 1B 3'UTR'yi ayrı ayrı karıştırdı. Ardından, penisilin ve streptomisin kullanarak seçin, bu da luc RAB1B ve luc karıştırılmış olarak üretilmesine neden olur.
Daha sonra, hücreleri daha önce gösterildiği gibi pFLAG-HuR veya MT-PFLAG ile aktarın. HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 karıştırılmış, HeLa-Cre miR 17-92 HuR ve HeLa-Cre miR 1792 HuR kilidi ile akıcılığın yaklaşık% 80'ine ulaşılana kadar hücre kültürüne geçin. Daha sonra, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir mikrolitre doksisiklin ile indükleyin ve ayrıca tüm hücreleri aynı süre boyunca kontrol olarak doksisiklin olmadan tutun.
Farklı lüminesans yoğunluklarını ölçmek ve karşılaştırmak için, çift lusiferaz muhabir tahlil kitini kullanın. Tahlil başlamadan önce, lusiferaz tahlil çözeltilerini çözün ve oda sıcaklığında bırakın. Daha sonra, 200 mikrolitre substratı 10 mililitre lusiferaz tahlil tamponu ikisinde karıştırarak Stop ve Glo karışımını hazırlayın.
Daha sonra 10 mililitre lusiferaz testi tamponu ikiyi, karışımı hazırlamak için lusiferaz testi substratı iki'nin amber aşağılığına karıştırın ve iyice çalkalayın. Daha sonra, çözeltileri daha önce tanımlanmış ve ışıktan korunan 15 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Daha sonra, Sinerji gibi ekipmanları kullanarak lüminesans okumalarını gerçekleştirin ve ifade edilen lusiferazı göreceli ışık birimleri olarak ölçün ve ardından sonuçları daha fazla istatistiksel analiz için bir elektronik tabloya aktarın.
Renilla kontrolü ile ateşböceği lusiferaz aktivitesinin normalleştirilmesini gerçekleştirin ve doksisiklin indüksiyonu olan ve olmayan gruplar için tekrarlarken bunu bir grafikte göreceli ışık birimleri olarak çizin. pFLAG-HuR'nin transfeksiyonu üzerine HuR'nin aşırı ekspresyonu HeLa, BCPAP ve HEK293T hücre hattında doğrulandı ve bu hücrelerdeki HuR aşırı ekspresyonunun miR19A ekspresyonunu uyardığı gözlendi. HeLa-Cre hücrelerine kıyasla, pRD miR 17-92'den artmış miR19A ve miR19B ekspresyonu üzerine RAB1B 3'UTR ile lusiferaz aktivitesinde güçlü bir azalma gözlendi.
HeLa hücrelerinde pFLAG-HuR'nin transfeksiyonu lusiferaz aktivitesini değiştirmedi. Bununla birlikte, HuR'nin aşırı ekspresyonu, miR 17-92 kümesinin ekspresyonunu uyaran doksisiklin takviyesi ile birleştiğinde, lusiferaz aktivitesini daha da azaltmıştır. RNA bağlayıcı proteinin mikroRNA olgunlaşmasındaki rolünü doğruladıktan sonra, hücre kinetiği ve hücre döngüsü analizi, mikroRNA'larda protein tarafından teşvik edilen büyük değişiklikleri anlamak için önemli olacaktır.
