Il nostro protocollo affronta gli effetti delle proteine leganti l'RNA regolatorie sulla biogenesi e maturazione dei microRNA, direttamente da colture cellulari. Il metodo che descriviamo può essere eseguito con comuni reagenti di coltura cellulare ed è relativamente veloce. Questo metodo può essere importante per studiare gli effetti fenotipici dei microRNA e dei loro bersagli in diversi tipi di cellule eucariotiche.
Possono essere utilizzate cellule normali o simili alla malattia. È importante scegliere linee cellulari suscettibili di trasfezione, eseguire adeguati controlli di trasfezione e induzione al fine di osservare i cambiamenti di affinità target attraverso l'attività della luciferasi. Per iniziare, mantenere le cellule in DMEM, integratore di glucosio elevato in piastre di Petri da 100 millimetri e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato e ad atmosfera controllata con il 5% di anidride carbonica.
Per staccare le cellule aderenti, incubarlo con una soluzione di tripsina-EDTA a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Per eseguire le trasfezioni, mescolare 200 nanogrammi di DNA e 1,25 microlitri di reagente di trasfezione in 100 microlitri del terreno di coltura e aggiungere la miscela di trasfezione alle cellule. Quindi, incubare le cellule con le miscele di trasfezione per quattro ore a 37 gradi Celsius.
Quindi sostituire il terreno con un mezzo contenente il 10% di FBS e incubare per altre 24 ore prima di aggiungere gli antibiotici per la selezione. Per trasfettare pFLAG-HuR e MT-pFLAG in HeLa, selezionare le cellule aumentando la concentrazione di geneticina da 100 microgrammi per millilitro a 1000 microgrammi per millilitro, generando linee cellulari stabili. Quindi, confermare la sovraespressione con PCR quantitativa utilizzando primer specifici per l'mRNA HuR.
Trasfettare i plasmidi nelle cellule HeLa-Cre con 40 nanogrammi di pTK-Renilla, quindi pRD miR 17-92, generando HeLa-Cre miR 17-92 e selezionando con un microgrammo per millilitro di puromicina. Quindi, trasfettare HeLa-Cre miR 17-92 con pTK-Renilla e pmirGLO RAB1B 3'UTR o pmirGLO strapazzato 1B 3'UTR separatamente. Quindi, selezionare utilizzando penicillina e streptomicina, con conseguente generazione di luc RAB1B e luc strapazzato.
Quindi, trasfettare le cellule con pFLAG-HuR o MT-PFLAG come hanno dimostrato in precedenza. Procedere alla coltura cellulare con HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 strapazzato, HeLa-Cre miR 17-92 HuR e HeLa-Cre miR 1792 HuR blocco fino a raggiungere circa l'80% della confluenza. Quindi, indurre con un microlitro di doxiciclina per 30 minuti a 37 gradi Celsius e mantenere anche tutte le cellule senza doxiciclina come controlli per lo stesso periodo.
Per quantificare e confrontare diverse intensità di luminescenza, utilizzare il kit di analisi del reporter a doppia luciferasi. Prima di iniziare il test, scongelare le soluzioni di analisi della luciferasi e lasciarle a temperatura ambiente. Quindi, preparare la miscela Stop e Glo mescolando 200 microlitri del substrato in 10 millilitri di test di luciferasi tampone due.
Quindi mescolare 10 millilitri di tampone per il saggio della luciferasi due nel vile ambrato del substrato del saggio della luciferasi due per preparare la miscela, LAR II, e agitare bene. Successivamente, trasferire le soluzioni in provette da centrifuga da 15 millilitri precedentemente identificate e protette dalla luce. Successivamente, eseguire le letture della luminescenza utilizzando apparecchiature come Synergy e misurare la luciferasi espressa come unità di luce relativa, quindi esportare i risultati in un foglio di calcolo per ulteriori analisi statistiche.
Eseguire la normalizzazione dell'attività della luciferasi della lucciola mediante il controllo Renilla e tracciarla come unità di luce relativa in un grafico mentre si ripete per gruppi con e senza induzione della doxiciclina. La sovraespressione di HuR dopo trasfezione di pFLAG-HuR è stata confermata nella linea cellulare HeLa, BCPAP e HEK293T, ed è stato osservato che la sovraespressione di HuR in queste cellule stimola l'espressione di miR19A. Una forte riduzione dell'attività della luciferasi è stata osservata con RAB1B 3'UTR dopo un aumento dell'espressione di miR19A e miR19B da pRD miR 17-92, rispetto alle cellule HeLa-Cre.
La trasfezione di pFLAG-HuR nelle cellule HeLa non ha modificato l'attività della luciferasi. Tuttavia, la sovraespressione di HuR, unita alla supplementazione di doxiciclina che stimola l'espressione del cluster miR 17-92, ha ulteriormente ridotto l'attività della luciferasi. Dopo aver confermato il ruolo della proteina legante l'RNA nella maturazione dei microRNA, la cinetica cellulare e l'analisi del ciclo cellulare saranno importanti per comprendere i principali cambiamenti promossi dalla proteina nei microRNA.
