Наш протокол рассматривает влияние регуляторных РНК-связывающих белков на биогенез и созревание микроРНК непосредственно из клеточных культур. Метод, который мы описываем, может быть выполнен с помощью обычных реагентов клеточной культуры и является относительно быстрым. Этот метод может быть важен для изучения фенотипических эффектов микроРНК и их мишеней в различных типах эукариотических клеток.
Могут быть использованы нормальные или похожие на болезнь клетки. Важно выбрать клеточные линии, поддающиеся трансфекции, выполнить адекватный трансфекционный и индукционный контроль, чтобы наблюдать изменения в целевом сродстве через активность люциферазы. Для начала поддерживайте клетки в DMEM, добавляйте высокий уровень глюкозы в 100-миллиметровые чашки Петри и инкубируйте клетки при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с контролируемой атмосферой с 5% углекислым газом.
Чтобы отсоединить адгезивные клетки, инкубируют его раствором трипсина-ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти минут. Для выполнения трансфекции смешивают 200 нанограммов ДНК и 1,25 микролитра трансфекционного реагента в 100 микролитрах питательной среды и добавляют трансфекционную смесь в клетки. Затем инкубируют клетки с трансфекционными смесями в течение четырех часов при 37 градусах Цельсия.
Затем замените среду средой, содержащей 10% FBS, и инкубируйте еще 24 часа перед добавлением антибиотиков для отбора. Чтобы трансфектировать pFLAG-HuR и MT-pFLAG в HeLa, отбирайте клетки, увеличивая концентрацию генерина со 100 микрограмм на миллилитр до 1000 микрограмм на миллилитр, генерируя стабильные клеточные линии. Затем подтверждают сверхэкспрессию количественной ПЦР с помощью специфических праймеров для HuR мРНК.
Трансфектируйте плазмиды в клетках HeLa-Cre с помощью 40 нанограммов pTK-Renilla, затем pRD miR 17-92, генерируя HeLa-Cre miR 17-92 и выбирая с одним микрограммом на миллилитр пуромицина. Затем, трансфект HeLa-Cre miR 17-92 с pTK-Renilla и pmirGLO RAB1B 3'UTR или pmirGLO скремблировали 1B 3'UTR отдельно. Затем выберите с использованием пенициллина и стрептомицина, в результате чего генерация luc RAB1B и luc scrambled.
Затем трансфектируйте клетки с помощью pFLAG-HuR или MT-PFLAG, как они демонстрировали ранее. Приступайте к клеточной культуре с помощью HeLa-Cre miR 17-92 luc, HeLa-Cre miR 17-92 scrambled, HeLa-Cre miR 17-92 HuR и HeLa-Cre miR 1792 HuR lock до достижения примерно 80% слияния. Затем индуцируйте один микролитр доксициклина в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия, а также сохраняйте все клетки без доксициклина в качестве контрольных в течение того же периода.
Для количественной оценки и сравнения различных интенсивностей люминесценции используйте двойной набор репортеров люциферазы. Перед началом анализа разморозьте растворы люциферазы и оставьте их при комнатной температуре. Далее готовят смесь Stop и Glo путем смешивания 200 микролитров субстрата в 10 миллилитрах буфера анализа люциферазы два.
Затем смешайте 10 миллилитров буфера анализа люциферазы два в янтарной мерзкой субстрата для анализа люциферазы два, чтобы приготовить смесь, LAR II, и хорошо встряхнуть. После этого перенесите растворы в 15-миллилитровые центрифужные трубки, предварительно идентифицированные и защищенные от света. Затем выполните показания люминесценции с помощью такого оборудования, как Synergy, и измерьте выраженную люциферазу как относительные световые единицы, а затем экспортируйте результаты в электронную таблицу для дальнейшего статистического анализа.
Выполните нормализацию активности люциферазы светлячка с помощью контрольной Renilla и постройте ее как относительные световые единицы на графике, повторяя для групп с индукторизацией доксициклина и без нее. Сверхэкспрессия HuR при трансфекции pFLAG-HuR была подтверждена в клеточной линии HeLa, BCPAP и HEK293T, и было замечено, что сверхэкспрессия HuR в этих клетках стимулирует экспрессию miR19A. Сильное снижение активности люциферазы наблюдалось при RAB1B 3'UTR при увеличении экспрессии miR19A и miR19B от pRD miR 17-92 по сравнению с клетками HeLa-Cre.
Трансфекция pFLAG-HuR в клетках HeLa не изменяла активность люциферазы. Однако сверхэкспрессия HuR в сочетании с добавками доксициклина, стимулирующими экспрессию кластера miR 17-92, еще больше снижала активность люциферазы. После подтверждения роли РНК-связывающего белка в созревании микроРНК, кинетика клеток и анализ клеточного цикла будут важны для понимания основных изменений, способствующих белку в микроРНК.
