Bu protokol önemlidir, çünkü dokunun mimarisini bozmadan, daha önce yaralandıktan ve canlı olarak görüntülendikten sonra bile, Drosophila pupa'nın notumu üzerinde immünohistokimya yapmanıza izin verir. Bu teknik, notum epitelindeki hücreleri, yapıları ve proteinleri boyamak için halihazırda mevcut olan çok çeşitli antikor lekelerinden yararlanmanızı sağlar. Bu tekniği immünokimya ve DNA boyama için kullandık.
Bununla birlikte, bu diseksiyon, in situ hibridizasyon gibi diğer teknikler için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Bu protokol zor olabilir, çünkü pupa küçük ve hassastır, bu nedenle diseksiyonu gerçekleştirmek için sabit bir el gerektirir. Ve deneyimle daha da kolaylaşır, bu yüzden önemli olanlardan önce önemsiz pupalar üzerinde pratik yapın.
Bir diseksiyon kapsamı kullanarak P5 aşamasında üç ila dört pupayı dikkatlice çıkararak başlayın ve bunları bandın yanındaki mikroskop slaytında toplayın. Daha sonra, pupaları en az bir pupa genişliğinde, ventral tarafları aşağı bakacak şekilde bant üzerine yerleştirin. Şimdi, bir parrafin filmine veya bir santrifüj tüpü kapağına bir damla yapışkan yapıştırıcı yerleştirin.
Daha sonra, 0,1 ila 10 mikrolitrelik pipet ucunun ucunu yapışkan tutkal damlasına batırın ve pipet ucuna bir kapak kayması üzerine iki kez, bir köşeden bir santimetre uzakta, pupanın yaklaşık yarısı kadar bir yapışkan yapıştırıcı çizgisi oluşturarak dokunun. Ardından, iki mikrolitrede bir P2 pipeti ve 200 mikrolitre hacimde bir P200 pipeti önceden ayarlayın ve uçlarıyla takın. Şimdi, forsepsleri başın yan tarafına yakın bir yere yerleştirin ve anteriordan posteriora doğru çalışarak göz bebeği kasasının mümkün olduğunca çoğunu yavaşça çıkarın.
Daha sonra, pupa'nın gelişmekte olan bacaklarını bir çift künt forseps ile kavrayın ve pupa'yı kasasından dikkatlice çekin. Pupa'yı kapak fişinin köşesine yerleştirin. Pupa'yı arka karın bölgesinde veya gelişmekte olan kanatta künt forsepslerle kavrayın.
Pupa'nın ventral tarafını yukarı kaldırın ve yapışkan tutkal hattına yerleştirin. P2 pipeti, 0.1 milimolar kalsiyum içeren iki mikrolitre tek mukavemetli PBS ile hızlı bir şekilde doldurun ve havada tutun, ucunda küçük bir kabarcık oluşturacak kadar dışarı atın. Çözeltinin küçük kabarcığını, toraksın tabanındaki pupa'nın bir tarafına dokunun, ardından prosedürü diğer tarafta tekrarlayın.
Daha sonra, P200 pipeti, 200 mikrolitre tek mukavemetli PBS ile, 0,1 milimolar kalsiyum ile doldurun, ardından pipetin ucunu toraksın üzerine yerleştirin ve pupaları tamamen batırmak için içeriği dışarı atın ve yapışkan yapıştırıcının geri kalanı hemen katılaşacaktır. Şimdi, PBS çözeltisinin yaklaşık 100 mikrolitresini çıkarın, böylece hemen bir sonraki adıma geçmeden önce pupa zar zor suya batırılır. Notumu incelemek için, sapın bir tarafını baskın elin işaret parmağına ve orta parmağına karşı destekleyen bir çift mikro diseksiyon makası tutun, böylece baskın elin baş parmağı kesme kuvvetini uygular.
Daha sonra, makasın boynunu baskın olmayan elin orta parmağına karşı stabilize ederken, kapak kaymasını baskın olmayan elin yüzük parmağıyla destekleyin. Şimdi, yaklaşık 0.2 ila 0.5 milimetrelik küçük bir delik oluşturmak için sırt karnının ortasından kesin. Sırt dokusunu izole etmek için, dokudan posteriordan ön tarafa kadar küçük 0.5 ila 0.75 milimetrelik kesimler yapın ve sonunda bunlar dorsal dokuyu çevreleyecektir.
Ayrıca, pupaların diğer tarafındaki ön kesimlere posterior tekrarlayın. Gerekirse kafadan temiz bir kesim sağlamak için diseksiyon aşamasını döndürün. Notumun izole edilip edilmediğini, kolayca hareket ettirilip ettirilmediğini görerek belirleyin.
Kapak kaymasının ortasına yaklaşık 200 mikrolitre tek mukavemetli PBS ekleyin ve pipet ucunu kapak camı boyunca nazikçe sürükleyerek yeni damlacıktan orijinal damlacığa bağlayarak orijinal diseksiyon damlacığına bağlayan bir kanal oluşturun. Bir çift künt forseps kullanarak, izole edilmiş notumu yavaşça kapağın ortasına itin veya sürükleyin ve döndürün, böylece iç taraf yukarı bakacak şekilde döndürülür. Notumu künt forsepslerle karın veya baş bölümüne bastırarak aşağı doğru tutun.
200 mikrolitrelik bir pipetten bir çift keskin forseps ve tek kuvvetli PBS'nin nazikçe atılması kullanarak, tek katmanlı epiteli tamamen ortaya çıkarmak için kalan yağ gövdesini, kas bantlarını veya hemo lifti çıkarın. Doku temizlendikten sonra, notumun aspire edilmesini önlemek için PBS çözeltisinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın, diseksiyon kapsamı ile izleyin. Maksimum sıvı çıkarılmasından sonra, yapışkan yapıştırıcının geri kalanını, göz bebeği karkasını ve kapak kayması üzerindeki diğer kalıntıları dikkatlice silmek için emici bir doku kullanın.
Şimdi, 150 ila 200 mikrolitre% 4 PFA ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika sabitleyin. Diseksiyon hızına bağlı olarak, ilk pupanın ayrı kapak kaymalarına sabitlenmesi sırasında bir ila üç pupa daha diseke edilebilir. Notumu 30 saniye boyunca bir kez yıkamak için PFA'yı çıkarın ve tek mukavemetli PBS ile değiştirin.
Antikor boyama işlemine devam ediyorsanız, antijen hücre içi ise dokuyu geçirgenleştirmek için tek kuvvetli PBS veya PBST'de üç beş dakikalık yıkama yapın. Numune, nemlendirilmiş bir odada gece boyunca% 0.02 sodyum azid ile tek mukavemetli PBS'de saklanabilir. Boyama işleminden sonra, desteklerle birlikte topper olarak adlandırılan yeni bir kapak kayması hazırlayın.
Topper'ın ortasında, yaklaşık bir santimetre arayla 22 x 22 kapak kaymasından yapılmış ara parçaları kullanarak yaklaşık 200 mikrometrelik bir boşluk oluşturun. Yapışmak için, ara parçanın dikişini, merkezden en uzakta, ince bir oje tabakasıyla boyayın ve sonra kurumaya bırakın. Sulu çözeltinin mümkün olduğunca çoğunu numuneden çıkarın ve derhal numuneye iki damla solma önleyici montaj ortamı uygulayın.
Gerekirse, notumu solmaya karşı montaj orta damlacık merkezine yerleştirmek için temiz keskin forseps kullanın. Kapak kaymasını notumla, numuneyi çalışma yüzeyine yapışmayacak şekilde yükseltmek için yaklaşık 10 x 40 milimetrelik bir köpük desteğinin üzerine yerleştirin. Bir diseksiyon kapsamı altında, üst kısmı yavaşça numunenin üzerine indirin.
Solmaya karşı koruma montaj ortamı üst kısımla buluştuğunda, yavaşça serbest bırakın ve kılcal hareketin üstünü aşağı çekmesine izin verin. Üst kısma başka bir köpük parçası yerleştirin ve numune kapağı kayması, üst kısım ve ara parçalar arasındaki solmaya karşı montaj ortamını nazikçe koaksiyel hale getirmek için ağırlık olarak standart bir mikroskop sürgüsü kullanın. 5-10 dakika sonra, kapak kaymasının kenarlarına hafifçe dokunarak, fazla solmaya karşı montaj ortamını uzaklaştırmak için emici bir doku kullanın.
Birbirine yapıştırmak için kapak fişlerinin her köşesine nazikçe oje uygulayın. Kapak kaymasının kaymasını ve sırt dokusuna zarar vermesini önlemek için, önce kaplama kenarlarından kaçının ve köşelerdeki oje kuruduktan sonra, kapak kaymalarının tüm kenarlarını sızdırmazlık sağlayacak şekilde boyayın. Bu protokol, antikorlar ve hücresel lekeler kullanılarak sabit numunelerin görüntülenmesini sağlar.
Bu protokol, daha önce yaralanan ve canlı görüntü alınan örneklerde kullanılabilir. Canlı ve sabit görüntülerin karşılaştırılması, protokolün doku mimarisini ve morfolojisini koruduğunu göstermektedir. Protokol, disseke edilmiş bir notumun farklı görünümlerine izin verir.
Apikal görünüm, kütikülün altındaki epitel hücre sınırlarını ve çekirdeklerini görselleştirmek için idealdir. Bazal görünüm, yara kenarındaki bazal yapıları daha iyi ortaya çıkarır. Diseksiyon sırasında notumu bükmediğinizden veya bükmediğinizden emin olun.
Yanal kenarlardan kaçınarak düz bir parça kesin. Ventral taraflara çok yakın kesmeyin, aksi takdirde montaj sırasında deforme olur. Bir öğrenci notumunu diseke ettikten sonra, elektron mikroskobu ve kesitleme gibi birçok başka teknik uygulanabilir.
Bu teknikler, daha önce görüntülenen yapıların çok ayrıntılı olarak araştırılmasına izin verebilir.
