Этот протокол имеет большое значение, поскольку позволяет делать иммуногистохимию на нотуме куколок дрозофилы даже после того, как они были ранее ранены, и вживую изображены, не нарушая архитектуру ткани. Этот метод позволяет использовать широкий спектр уже доступных пятен антител для окрашивания клеток, структур и белков в эпителии notum. Мы использовали эту технику для иммунохимии и окрашивания ДНК.
Однако это рассечение может быть использовано в качестве отправной точки для других методов, таких как гибридизация in situ. Этот протокол может быть сложным, потому что куколки маленькие и деликатные, поэтому для выполнения вскрытия требуется твердая рука. И это становится легче с опытом, поэтому практикуйтесь на неважных куколках перед важными.
Начните с тщательного удаления трех-четырех куколок на стадии P5, используя рассечение, и соберите их на слайде микроскопа рядом с лентой. Затем поместите куколок по крайней мере на одну ширину куколки друг от друга, на ленту, их вентральными сторонами вниз. Теперь поместите каплю клеевого клея на паррафиновую пленку или в крышку трубки центрифуги.
Затем окуните конец наконечника пипетки от 0,1 до 10 микролитров в каплю клеевого клея и дважды постучите по кончику пипетки по крышке, на расстоянии одного сантиметра от угла, создавая линию клеевого клея, примерно половину длины куколки. Затем предустановите пипетку P2 на два микролитра и пипетку P200 на объем 200 микролитров и подгоните их наконечниками. Теперь вставьте щипцы рядом с боковой частью головы и аккуратно удалите как можно больше корпуса зрачка, работая от передней до задней.
Затем схватите развивающиеся ноги куколки парой тупых щипцов и осторожно вытащите куколку из ее футляра. Положите куколку в угол крышки. Захватите куколку у заднего брюшка, или развивающегося крыла, тупыми щипцами.
Поднимите и поместите вентральную сторону куколки вниз, в линию клеевого клея. Быстро заполните пипетку P2 двумя микролитрами однопрочного PBS, содержащего 0,1 миллимолярного кальция, и удерживая его в воздухе, выталкивайте ровно столько, чтобы образовался небольшой пузырьок на кончике. Прикоснитесь к маленькому пузырьку раствора, к одной стороне куколки у основания грудной клетки, затем повторите процедуру с другой стороны.
Затем заполните пипетку P200 200 микролитрами однопрочного PBS 0,1 миллимолярным кальцием, затем поместите наконечник пипетки над грудной клеткой и изгоните содержимое, чтобы полностью погрузить куколки, а оставшаяся часть клеевого клея немедленно затвердеет. Теперь удалите примерно 100 микролитров раствора PBS, чтобы куколка едва погрузилась, прежде чем сразу перейти к следующему шагу. Чтобы рассечь нотум, возьмите пару микро-ножниц для рассечения, прикрепляя одну сторону ручки к указательному и среднему пальцам доминирующей руки, чтобы большой палец доминирующей руки применял режущую силу.
Далее стабилизируйте шейку ножниц к среднему пальцу недоминирующей руки, при этом укрепляя крышку скольжения, безымянным пальцем недоминирующей руки. Теперь нарежьте в середине спинного брюшка, чтобы создать небольшое отверстие примерно от 0,2 до 0,5 миллиметра. Чтобы изолировать дорсальную ткань, сделайте небольшие разрезы от 0,5 до 0,75 миллиметра через покров, от задней до передней, и в конце концов, они будут окружать дорсальную ткань.
Далее повторите задние и передние надрезы на другой стороне куколок. Поверните стадию рассечения, чтобы при необходимости дать возможность чистого разреза через голову. Определите, был ли нотум изолирован, посмотрев, легко ли он перемещается.
Добавьте около 200 микролитров однопрочного PBS в центр крышки и сделайте канал, соединяющий его с исходной каплей рассечения, осторожно перетащив наконечник пипетки по стеклу крышки, от новой капли к исходной. Используя пару тупых щипцов, осторожно нажмите или перетащите изолированный нотум к центру крышки, скользите и вращайте, чтобы внутренняя сторона была обращена вверх. Удерживайте нотум тупыми щипцами, вдавливая в брюшную или головную часть.
Используя пару острых щипцов и мягкое изгнание однопрочного PBS из 200-микролитровой пипетки, удалите все оставшиеся жировые тела, мышечные полосы или гемолифтинг, чтобы полностью обнажить монослойный эпителий. Как только ткань будет очищена, используйте пипетку объемом 200 микролитров, чтобы удалить как можно больше раствора PBS, контролируя с помощью рассечения, чтобы избежать аспирации нотума. После максимального удаления жидкости используйте абсорбирующую ткань, чтобы тщательно вытереть остальной клейкий клей, тушу зрачка и другой мусор на крышке.
Теперь добавьте от 150 до 200 микролитров 4% PFA и зафиксируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. И в зависимости от скорости рассечения, еще одна-три куколки могут быть рассечены, во время фиксации первой куколки на отдельных скольжениях крышки. Снимите PFA и замените его однопрочным PBS, чтобы промыть нотум один раз в течение 30 секунд.
Если продолжается окрашивание антителами, выполните три пятиминутные промывки, в однопрочных PBS или PBST, чтобы проникнуть в ткань, если антиген является внутриклеточным. Образец может храниться в однопрочном PBS с 0,02% азида натрия в течение ночи в увлажненной камере. После окрашивания подготовьте новую крышку, называемую топпером, с опорами.
Создайте зазор примерно в 200 микрометров, используя распорки, сделанные из 22 на 22 скольжения крышки, примерно на расстоянии одного сантиметра друг от друга, в середине топпера. Чтобы прилипнуть, покрасьте шов распорки, наиболее удаленный от центра, тонким слоем лака для ногтей, а затем дайте ему высохнуть. Извлеките из образца как можно больше водного раствора и немедленно нанесите на образец две капли антивяхлой монтажной среды.
При необходимости используйте чистые острые щипцы, чтобы расположить нотум в анти-выцветающем монтаже среднего центра капель. Поместите крышку с нотом на подставку из пенопласта размером примерно 10 на 40 миллиметров, чтобы поднять образец, чтобы он не прилип к рабочей поверхности. Под областью рассечения медленно опустите верхнюю часть на образец.
Как только анти-выцветающая монтажная среда встретится с топпером, осторожно отпустите и позвольте капиллярному действию потянуть верхушку вниз. Поместите еще один кусок пены на топпер и используйте стандартный предметный предмет микроскопа в качестве веса, чтобы осторожно уговорить анти-выцветающую монтажную среду между проскальзыванием крышки образца, топпером и распорками. Через 5-10 минут используйте абсорбирующую ткань, чтобы удалить любую лишнюю анти-выцветающую монтажную среду, осторожно коснувшись краев крышки.
Аккуратно нанесите лак для ногтей на каждый угол крышки, чтобы склеить их вместе. Чтобы предотвратить скольжение крышки и повреждение спинной ткани, сначала избегайте покрытия краев, а как только лак для ногтей в углах высохнет, покрасьте все края крышки, чтобы запечатать. Этот протокол позволяет визуализировать фиксированные образцы, используя антитела и клеточные пятна.
Этот протокол может быть использован на образцах, которые были ранее ранены и изображены в реальном времени. Сравнение живых и фиксированных изображений показывает, что протокол сохраняет архитектуру и морфологию тканей. Протокол допускает различные виды препарированного нотума.
Апикальный вид идеально подходит для визуализации границ эпителиальных клеток и ядер ниже кутикулы. Базальный вид лучше раскрывает базальные структуры на крае раны. Не сгибайте и не деформируйте нотум во время рассечения.
Вырежьте плоский кусок, избегая боковых краев. Не срежьте слишком близко к брютральным сторонам, иначе он будет деформироваться во время монтажа. После вскрытия нотного зрачка могут быть применены многие другие методы, такие как электронная микроскопия и поперечное сечение.
Эти методы могут позволить исследовать ранее изображенные структуры в огромных деталях.
