Ce protocole est important, car il vous permet de faire de l’immunohistochimie sur le notum de la nymphe drosophile, même après qu’ils aient été précédemment blessés et photographiés en direct, sans perturber l’architecture du tissu. Cette technique vous permet de profiter de la large gamme de taches d’anticorps déjà disponibles pour colorer les cellules, les structures et les protéines de l’épithélium notum. Nous avons utilisé cette technique pour l’immunochimie et la coloration de l’ADN.
Cependant, cette dissection pourrait être utilisée comme point de départ pour d’autres techniques, telles que l’hybridation in situ. Ce protocole peut être difficile, car les nymphes sont petites et délicates, il faut donc une main ferme pour effectuer la dissection. Et cela devient plus facile avec l’expérience, alors pratiquez sur des nymphes sans importance avant les importantes.
Commencez par retirer soigneusement trois à quatre nymphes au stade P5, à l’aide d’une lunette de dissection, et collectez-les sur la lame du microscope à côté de la bande. Ensuite, placez les nymphes à au moins une largeur de nymphe l’une de l’autre, sur le ruban adhésif, avec leurs côtés ventraux vers le bas. Maintenant, placez une goutte de colle adhésive sur un film de parrafine ou dans un couvercle de tube de centrifugeuse.
Ensuite, trempez l’extrémité d’une pointe de pipette de 0,1 à 10 microlitres dans la goutte de colle adhésive et tapotez la pointe de la pipette deux fois sur un glissement de couverture, à un centimètre par un centimètre d’un coin, créant une ligne de colle adhésive, environ la moitié de la longueur de la nymphe. Ensuite, préréglez une pipette P2 à deux microlitres et une pipette P200 à un volume de 200 microlitres et équipez-les de pointes. Maintenant, insérez des pinces près du côté de la tête et retirez doucement autant que possible le boîtier de la pupille, en travaillant de l’antérieur vers le postérieur.
Ensuite, saisissez les pattes en développement de la nymphe, avec une paire de pinces émoussées, et tirez soigneusement la nymphe de son étui. Posez la nymphe dans le coin du bordereau de couverture. Saisissez la nymphe à l’abdomen postérieur, ou à l’aile en développement, avec une pince émoussée.
Soulevez et placez la face ventrale de la nymphe vers le bas, dans la ligne de colle adhésive. Remplissez rapidement la pipette P2, avec deux microlitres de PBS à force unique, contenant 0,1 millimolaire de calcium, et maintenez-la dans l’air, expulsez juste assez pour former une petite bulle à l’extrémité. Touchez la petite bulle de la solution, d’un côté de la nymphe à la base du thorax, puis répétez la procédure de l’autre côté.
Ensuite, remplissez la pipette P200, avec 200 microlitres de PBS à résistance unique, avec 0,1 millimolaire de calcium, puis placez la pointe de la pipette sur le thorax et expulsez le contenu pour submerger complètement les nymphes, et le reste de la colle adhésive se solidifiera immédiatement. Maintenant, retirez environ 100 microlitres de la solution PBS, de sorte que la nymphe soit à peine submergée, avant de passer immédiatement à l’étape suivante. Pour disséquer le notum, saisissez une paire de ciseaux à micro dissection, en serrant un côté du manche contre l’index et le majeur de la main dominante, de sorte que le pouce de la main dominante applique la force de coupe.
Ensuite, stabilisez le cou des ciseaux contre le majeur de la main non dominante, tout en appuyant le glissement de couverture, avec l’annulaire de la main non dominante. Maintenant, coupez au milieu de l’abdomen dorsal pour créer un petit trou d’environ 0,2 à 0,5 millimètre. Pour isoler le tissu dorsal, faites de petites coupures de 0,5 à 0,75 millimètre à travers le tégument, du postérieur à l’antérieur, et à la fin, celles-ci encercleront le tissu dorsal.
De plus, répétez les coupures postérieures à antérieures de l’autre côté des pupes. Faites pivoter l’étape de dissection pour permettre une coupe nette à travers la tête si nécessaire. Déterminez si le notum a été isolé, en voyant s’il est facilement déplacé.
Ajoutez environ 200 microlitres de PBS à résistance unique au centre du couvercle et créez un canal le reliant à la gouttelette de dissection d’origine, en faisant glisser doucement la pointe de la pipette sur le verre de couverture, de la nouvelle gouttelette à l’original. À l’aide d’une paire de pinces contondantes, poussez ou faites glisser doucement le notum isolé vers le centre du couvercle et faites pivoter, de sorte que le côté intérieur soit orienté vers le haut. Maintenez le notum vers le bas avec des pinces contondantes, en appuyant dans la section abdominale ou de la tête.
À l’aide d’une paire de pinces tranchantes et d’expulsions douces de PBS à force unique, à partir d’une pipette de 200 microlitres, retirez tout corps gras restant, les bandes musculaires ou l’hémo lift, pour exposer complètement l’épithélium monocouche. Une fois le tissu propre, utilisez une pipette de 200 microlitres pour retirer autant de solution de PBS que possible, en surveillant avec la portée de dissection, pour éviter d’aspirer le notum. Après avoir retiré le liquide au maximum, utilisez un tissu absorbant pour essuyer soigneusement le reste de la colle adhésive, de la carcasse de la pupille et d’autres débris sur le couvercle.
Maintenant, ajoutez 150 à 200 microlitres de 4% de PFA et fixez pendant 20 minutes à température ambiante. Et selon la vitesse de dissection, une à trois nymphes supplémentaires peuvent être disséquées, lors de la fixation de la première nymphe sur des glissières de couverture séparées. Retirez le PFA et remplacez-le par du PBS monoconducteur pour laver le notum une fois pendant 30 secondes.
Si vous procédez à la coloration des anticorps, effectuez trois lavages de cinq minutes, dans un PBS ou un PBST à concentration unique, pour perméabiliser le tissu si l’antigène est intracellulaire. L’échantillon peut être stocké dans un PBS monoconducteur, avec 0,02% d’azoture de sodium pendant la nuit dans une chambre humidifiée. Après la coloration, préparez un nouveau couvercle appelé topper, avec des supports.
Créez un espace d’environ 200 micromètres, en utilisant des entretoises faites de glissières de couverture de 22 par 22, espacées d’environ un centimètre, au milieu du topper. Pour adhérer, peignez la couture de l’entretoise la plus éloignée du centre, avec une fine couche de vernis à ongles, puis laissez-la sécher. Retirez autant que possible la solution aqueuse de l’échantillon et appliquez immédiatement deux gouttes de support de montage anti-décoloration sur l’échantillon.
Si nécessaire, utilisez des pinces tranchantes propres pour positionner le notum dans le centre de gouttelettes moyennes de montage anti-décoloration. Placez le couvercle avec le notum sur un support en mousse d’environ 10 x 40 millimètres pour élever l’échantillon afin qu’il n’adhère pas à la surface de travail. Sous une portée de dissection, abaissez lentement le topper sur l’échantillon.
Une fois que le support de montage anti-décoloration rencontre le topper, relâchez doucement et laissez l’action capillaire tirer le topper vers le bas. Placez un autre morceau de mousse sur le surmatelas et utilisez une lame de microscope standard comme poids pour amadouer doucement le support de montage anti-décoloration entre le glissement du couvercle de l’échantillon, le topper et les entretoises. Après 5 à 10 minutes, utilisez un tissu absorbant pour évacuer tout excès de support de montage anti-décoloration, en touchant doucement les bords du glissement du couvercle.
Appliquez doucement du vernis à ongles sur chaque coin des glissières de couverture pour les coller ensemble. Pour éviter que le couvercle ne glisse et n’endommage le tissu dorsal, évitez d’abord les bords de revêtement et, une fois que le vernis à ongles dans les coins sèche, peignez tous les bords du couvercle pour sceller. Ce protocole permet l’imagerie des échantillons fixes, en utilisant des anticorps et des taches cellulaires.
Ce protocole peut être utilisé sur des échantillons qui ont déjà été blessés et photographiés en direct. Une comparaison d’images vivantes et fixes, montre que le protocole préserve l’architecture et la morphologie des tissus. Le protocole permet différentes vues d’un notum disséqué.
La vue apicale est idéale pour visualiser les bordures et les noyaux des cellules épithéliales, sous la cuticule. La vue basale révèle mieux les structures basales au bord de la plaie. Assurez-vous de ne pas plier ou déformer le notum pendant la dissection.
Coupez un morceau plat en évitant les bords latéraux. Ne coupez pas trop près des côtés ventraux, sinon il se déformera pendant le montage. Après avoir disséqué un notum pupille, de nombreuses autres techniques pourraient être appliquées, telles que la microscopie électronique et la coupe transversale.
Ces techniques pourraient permettre d’étudier en détail des structures précédemment imagées.
