이 프로토콜은 Drosophila 번데기의 유역에서 면역 조직 화학을 수행 할 수 있기 때문에 이전에 상처를 입은 후에도 조직의 구조를 방해하지 않고 살아있는 이미지를 얻을 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술을 사용하면 이미 사용 가능한 광범위한 항체 염색을 활용하여 노툼 상피에서 세포, 구조 및 단백질을 염색 할 수 있습니다. 우리는이 기술을 면역 화학 및 DNA 염색에 사용했습니다.
그러나, 이러한 해부는 계내 혼성화와 같은 다른 기술의 시작점으로서 사용될 수 있다. 번데기가 작고 섬세하기 때문에이 프로토콜은 어려울 수 있으므로 해부를 수행하려면 꾸준한 손이 필요합니다. 그리고 경험으로 더 쉬워지기 때문에 중요한 번데기보다 먼저 중요하지 않은 번데기를 연습하십시오.
해부 범위를 사용하여 P5 단계에서 세 개에서 네 개의 번데기를 조심스럽게 제거하고 테이프 옆의 현미경 슬라이드에 수집하십시오. 다음으로, 번데기를 적어도 하나의 번데기 너비를 테이프에 놓고 복부 측면을 아래로 놓습니다. 이제 파라핀 필름 또는 원심 분리기 튜브 뚜껑에 접착제 한 방울을 놓습니다.
다음으로, 접착제 접착제 방울에 0.1 ~ 10 마이크로 리터 피펫 팁의 끝을 담그고 커버 슬립에서 피펫 팁을 두 번 두드리고, 모서리에서 1 센티미터 씩 1 센티미터 떨어진 곳에 접착제 라인을 만들어 번데기 길이의 약 절반을 만듭니다. 다음으로 P2 피펫을 2 마이크로 리터로 사전 설정하고 P200 피펫을 200 마이크로 리터 부피로 미리 설정하고 팁으로 맞 춥니 다. 이제 머리 옆면 근처에 포셉을 삽입하고 가능한 한 많은 동공 케이스를 부드럽게 제거하고 앞쪽에서 뒤쪽으로 작업하십시오.
다음으로, 한 쌍의 둔한 포셉으로 번데기의 발달하는 다리를 잡고 조심스럽게 번데기를 케이스에서 당겨 내십시오. 번데기를 덮개 슬립의 모서리에 놓습니다. 후부 복부의 번데기 또는 무딘 집게로 발달하는 날개를 잡으십시오.
번데기의 복부 쪽을 들어 올려 접착제 라인에 넣으십시오. P2 피펫을 0.1 밀리몰 칼슘을 함유 한 단일 강도 PBS 2 마이크로 리터로 빠르게 채우고 공기 중에 유지하면 팁에 작은 거품이 생길 정도로 충분히 배출하십시오. 흉부 기저부에있는 번데기의 한쪽면에 용액의 작은 거품을 만진 다음 다른쪽에서 절차를 반복하십시오.
다음으로 P200 피펫을 200 마이크로 리터의 단일 강도 PBS로 채우고 0.1 밀리 몰 칼슘으로 피펫의 팁을 흉부 위에 놓고 내용물을 배출하여 번데기를 완전히 잠그면 접착제의 나머지 부분이 즉시 응고됩니다. 이제 PBS 용액 약 100 마이크로 리터를 제거하여 번데기가 거의 물에 잠기지 않도록 한 후 즉시 다음 단계로 진행하십시오. 노텀을 해부하려면 한 쌍의 마이크로 해부 가위를 잡고 핸들의 한쪽면을 지배적 인 손의 검지 손가락과 가운데 손가락에 대고 구부리면 지배적 인 손의 엄지 손가락이 절삭력을 적용합니다.
다음으로, 비 지배적 인 손의 가운데 손가락에 대해 가위의 목을 안정시키고, 비 지배적 인 손의 반지 손가락으로 커버 슬립을 구부리십시오. 이제 등쪽 복부의 중앙을 저격하여 약 0.2 ~ 0.5 밀리미터의 작은 구멍을 만듭니다. 등쪽 조직을 분리하려면 외피를 통해 후방에서 앞쪽까지 0.5 ~ 0.75 밀리미터의 작은 컷을 만들고 결국에는 등쪽 조직을 둘러 쌉니다.
또한, 번데기의 다른쪽에서 앞쪽 상처에 후방을 반복하십시오. 필요한 경우 머리를 깨끗하게 절단 할 수 있도록 해부 단계를 회전시킵니다. 노툼이 쉽게 이동되는지 확인하여 노텀이 격리되었는지 확인합니다.
커버 슬립의 중앙에 약 200 마이크로리터의 단일 강도 PBS를 첨가하고, 피펫 팁을 커버 글라스를 가로질러 부드럽게 드래그하여 원래의 해부 액적에 연결하는 채널을 만듭니다. 한 쌍의 무딘 포셉을 사용하여 분리 된 노텀을 커버 슬립의 중심으로 부드럽게 밀거나 드래그하고 회전하여 내부 측면이 위쪽을 향하게합니다. 무딘 포셉으로 노텀을 누르고 복부 또는 머리 부분을 누르십시오.
한 쌍의 날카로운 포셉과 200 마이크로 리터 피펫에서 단일 강도 PBS의 부드러운 배출을 사용하여 남아있는 지방체, 근육 밴드 또는 헤모 리프트를 제거하여 단층 상피를 완전히 노출시킵니다. 조직이 깨끗 해지면 200 마이크로 리터 피펫을 사용하여 PBS 용액을 가능한 한 많이 제거하고 해부 범위로 모니터링하여 노텀을 흡입하지 않도록하십시오. 최대 액체 제거 후 흡수 조직을 사용하여 덮개 슬립의 나머지 접착제, 동공 시체 및 기타 이물질을 조심스럽게 닦아냅니다.
이제 150 ~ 200 마이크로 리터의 4 % PFA를 넣고 실온에서 20 분 동안 고정하십시오. 그리고 해부 속도에 따라, 첫 번째 번데기가 별도의 덮개 슬립에 고정되는 동안 하나 ~ 세 개의 번데기를 해부 할 수 있습니다. PFA를 제거하고, 이를 단일 강도 PBS로 교체하고, 30초 동안 노툼을 한 번 세척하였다.
항체 염색을 진행하는 경우, 단일 강도 PBS 또는 PBST에서 세 번의 다섯 분 세척을 수행하여 항원이 세포 내 인 경우 조직을 투과시킵니다. 샘플은 가습 챔버에서 하룻밤 동안 0.02 % 나트륨 아지드와 함께 단일 강도 PBS에 보관할 수 있습니다. 염색 후, 지지대와 함께 토퍼라고 불리는 새로운 커버 슬립을 준비하십시오.
토퍼 중간에 약 한 센티미터 떨어진 22 x 22 커버 슬립으로 만든 스페이서를 사용하여 약 200 마이크로 미터의 간격을 만듭니다. 접착하려면 중앙에서 가장 멀리 떨어진 스페이서의 이음새를 얇은 매니큐어 층으로 페인트 한 다음 말리십시오. 샘플에서 가능한 한 많은 수용액을 제거하고 즉시 두 방울의 페이드 방지 장착 매체를 샘플에 적용하십시오.
필요한 경우 깨끗한 날카로운 포셉을 사용하여 노텀을 페이드 방지 장착 매체 액적 중앙에 배치합니다. 노텀이 있는 커버 슬립을 약 10 x 40 밀리미터 폼 지지대 위에 올려 시료가 작업 표면에 달라붙지 않도록 상승시킵니다. 해부 범위 아래에서 토퍼를 샘플에 천천히 내립니다.
페이드 방지 장착 매체가 토퍼를 만나면 부드럽게 풀고 모세관 작용으로 토퍼를 아래로 당깁니다. 다른 거품 조각을 토퍼 위에 놓고 표준 현미경 슬라이드를 무게로 사용하여 샘플 커버 슬립, 토퍼 및 스페이서 사이에 페이드 방지 장착 매체를 부드럽게 동축시킵니다. 5-10 분 후, 흡수 조직을 사용하여 커버 슬립의 가장자리를 부드럽게 만져서 과도한 퇴색 방지 장착 매체를 윅 제거합니다.
커버 슬립의 각 모서리에 매니큐어를 부드럽게 발라서 함께 붙입니다. 커버 슬립이 등쪽 조직을 이동시켜 손상시키지 않도록 하려면 먼저 가장자리를 코팅하지 말고 모서리의 매니큐어가 마르면 커버 슬립의 모든 가장자리를 밀봉에 페인트하십시오. 이 프로토콜은 항체 및 세포 얼룩을 사용하여 고정 된 샘플의 이미징을 허용합니다.
이 프로토콜은 이전에 부상을 입었고 실제 이미지화 된 샘플에 사용할 수 있습니다. 라이브 이미지와 고정 된 이미지의 비교는 프로토콜이 조직 구조 및 형태를 보존한다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 해부 된 notum에 대한 다른 견해를 허용합니다.
정점보기는 큐티클 아래의 상피 세포 경계와 핵을 시각화하는 데 이상적입니다. 기본 뷰는 상처 여백의 기본 구조를 더 잘 보여줍니다. 해부 중에 노텀을 구부리거나 뒤틀리지 않도록하십시오.
측면 가장자리를 피하여 평평한 조각을 자릅니다. 복부 측면에 너무 가깝게 자르지 말고, 그렇지 않으면 장착 중에 변형됩니다. 동공 노텀을 해부한 후, 전자 현미경 및 단면화와 같은 많은 다른 기술이 적용될 수 있었다.
이러한 기술을 통해 이전에 이미징 된 구조를 엄청나게 자세하게 조사 할 수 있습니다.
