تم اعتماد قياس الطيف الكتلي على نطاق واسع لمختلف التطبيقات. توفر المنهجية الواردة في هذه المقالة توصيفا لا لبس فيه لشظايا الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من عملية إنزيمية في المختبر. تشمل مزايا هذه التقنية أنه يتم الحصول على ذروة جزيء الحديد ، وأنه يمكن إجراء التجارب بكميات صغيرة من المواد للتطبيقات في المختبر ، وأنه يمكن إنجاز البروتوكول بأقل قدر من التدريب.
يمكن تطبيق المنهجية الموصوفة على نطاق واسع لدراسة العمليات التي تنطوي على الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتينات. وتشمل الأمثلة التحولات الكيميائية الحيوية مثل المعلومات المتقاطعة، وتحديد التعديلات الكيميائية، أو غيرها من تفاعلات البوليمر الحيوي والتفاعل. يمكن أن تحدث صعوبة واحدة من إمكانية الوصول إلى مطياف MALDI أو المرافق الأساسية التي تقدم هذه الخدمة.
جانب آخر هو تحديد حد الكشف الذي قد يكون أعلى أو أقل اعتمادا على الأداة. للبدء ، قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي UV-Vis ، ثم انقر فوق رمز PerkinElmer UV WinLab لفتح نافذة التحكم في تشغيل الجهاز. قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي لوحدة التحكم في درجة الحرارة Peltier باستخدام المفتاح الموجود على يمين الجهاز وانقر فوق Scan-Lambda 365 ، الموجود ضمن الطرق الأساسية.
سيتم فتح شاشة أخرى ومطالبة المستخدم بالتأكد من أن حاملات الخلايا فارغة. انقر فوق موافق واسمح للأداة بإجراء فحوصات النظام الخاصة بها. الآن ، اضبط معلمات المسح الضوئي عن طريق تحديد جمع البيانات.
في النافذة الجديدة ضمن إعدادات المسح الضوئي، قم بتغيير البداية إلى 350 نانومتر والنهاية إلى 215 نانومتر. قم بتنشيط Peltier عن طريق تحديد علامة الجمع الموجودة على يسار الملحق. ثم انقر فوق Peltier متعدد الخلايا ، وقم بتغيير درجة الحرارة المئوية إلى 25 ، وانقر فوق Peltier On.انتقل إلى علامة تبويب معلومات العينة وأدخل عدد العينات والأسماء وموضع الخلية المطلوب.
انقر فوق Autozero وأدخل cuvette الذي يحتوي على حل الخلفية. انقر فوق Start (ابدأ) وأدخل cuvette في الخلية المطلوبة وتأكد من توجيه نافذة cuvette بالتوازي مع الوجه الأمامي للأداة. الآن ، انقر فوق موافق لبدء الفحص الأول عند 25 درجة مئوية.
للحصول على قياسات في درجات حرارة أعلى ، انقر فوق Multi Cell Peltier ، وقم بتغيير درجة الحرارة إلى درجة حرارة العينة المطلوبة وكرر المسح. انقر فوق ملف ، تصدير واختر موقع الملف المطلوب وحدد XY Data للحصول على ملف نصي. لإجراء 5' فسفرة الحمض النووي الريبي ، قم بإعداد محلول في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 0.6 ميكرولتر عن طريق إضافة 33.5 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase ، وخمسة ميكرولترات من المحلول A ، وستة ميكرولايت من 10 ملليمولار أدينوسين ثلاثي الفوسفات ، وميكرولايت واحد من 200 محلول مائي للحمض النووي الريبي المموج ، و 4.5 ميكرولتر من كيناز متعدد النوكليوتيدات وخلط المحلول بلطف.
احتضن خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة عن طريق وضعه في حمام مائي. ثم تعطيل الإنزيم عن طريق وضع أنبوب التفاعل في كتلة حرارية ، مسخنة مسبقا عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. اسمح للمحلول بأن يبرد إلى درجة حرارة الغرفة لإنتاج محلول RNA نهائي مفسفر.
بعد الحضانة ، استخدم 50 ميكرولتر من هذا المحلول ، وأضف خمسة ميكرولترات من المحلول B ، وخمسة ميكرولترات من محلول 1-femtomole من Xrn-1 لإجراء التحلل المائي للحمض النووي الريبي. احتضان أنبوب التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. انقل خليط التفاعل هذا إلى جهاز طرد مركزي بحجم 10 كيلودالتون بحجم المسام وقم بتصفية الإنزيمات عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 700 مرة G.انقل الترشيح إلى أنبوب طرد مركزي سعة 0.6 ملليلتر.
ثم أضف 20 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase لغسل الحمض النووي الريبي المتبقي على أنبوب الطرد المركزي ، يليه الطرد المركزي. وأخيرا، اجمع هذا الترشيح مع الترشيح الناتج الذي تم الحصول عليه مسبقا عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي بحجم 10 كيلودالتون بحجم المسام، وقم بتجميد المحلول عند صفر درجة مئوية أو السفينة للتحليل. لإزالة الملح من العينة وتركيزها، استخدم أطراف ماصة C18 لتبادل الكاتيون المتاحة تجاريا والمحملة بسرير من وسائط كروماتوغرافيا C18 في نهايتها.
لهذا ، ضع طرف ماصة 10 ميكرولتر على ماصة سعة 10 ميكرولتر واغسل هذا الطرف مرتين بمحلول نتريل أسيتيل مائي بنسبة 50٪. تخلص من الكميات المستخدمة في أنبوب نفايات منفصل في كل مرة وقم بموازنة طرف C18 مع 10 ميكرولترات من محلول حمض ثلاثي فلورو أسيتيك المائي بنسبة 0.1٪ مرتين. قم بإزالة طرف C18 يدويا من الماصة وتثبيته على ماصة سعة 200 ميكرولتر تحتوي على طرف ماصة P200.
ثم اغمر طرف C18 في المحلول الناتج المحضر أثناء التحلل المائي ل oligonucleotides من الحمض النووي الريبي بواسطة Xrn-1 وقم بشفط المحلول من خلال طرف C18 10 مرات. الآن ، افصل طرف C18 عن ماصة P200 ، وضعه في ماصة سعة 10 ميكرولتر واغسل طرف C18 باستخدام محلول مائي من محلول حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 0.1٪ مرتين. تخلص من الكميات المستخدمة في أنبوب نفايات منفصل في كل مرة.
اغسل طرف C18 بماء خال من RNase سعة 10 ميكرولترات مرتين. للاكتشاف على لوحة MALDI ، قم بإلغاء أوليغونوكليوتيد الحمض النووي الريبي من طرف C18 عن طريق غمر العينة في المصفوفة المطلوبة وتوزيع المحلول مرة أخرى في الأنبوب 10 مرات. ضعي هذا المحلول على نقطتين منفصلتين لكل منهما ميكرولتر واحد على اللوحة واتركي البقع لتجف في الهواء.
تم تحديد تركيز الحمض النووي الريبي المستخدم في هذا العمل عن طريق التحليل الطيفي المرئي للأشعة فوق البنفسجية المسجل عند 90 درجة مئوية لتجنب القراءات الخاطئة الناشئة عن التكوين المحتمل للهياكل الثانوية. وشمل التسلسل العام للأحداث جزأين. الأول ، الفسفرة الفعالة 5' للحمض النووي الريبي ، يتضح من ظهور ذروة واحدة فقط تتوافق مع المنتج المتوقع.
والثاني ، الجزء المتوقف الناشئ عن معالجة خليط العينة مع Xrn-1. تم الحصول على نفس النتائج باستخدام تسلسل مختلف يحتوي على آفتين مؤكسدتين. وتشمل التغييرات المحتملة التي يجب مراعاتها القضاء على استخدام جهاز التصفية أو النظر في مصفوفات مختلفة لاكتشاف MALDI.
على سبيل المثال ، حمض السينابينيك أو حمض البيكولينيك. تم الحصول على شظايا الحمض النووي الريبي من عملية إنزيمية. تم تأسيس هذه العملية عن طريق اقتران MALDI ، والتحليل الكهربائي ، وتوليف الطور الصلب ، والثنائيات الدائرية.
البروتوكول الموصوف لديه القدرة على استخدامه في مختلف المجالات ، من البحوث في العلوم الكيميائية إلى التطبيقات في مجال الطب الحيوي.
