La espectrometría de masas ha sido ampliamente adoptada para diversas aplicaciones. La metodología de este artículo proporciona la caracterización inequívoca de fragmentos de ARN obtenidos a partir de un proceso enzimático in vitro. Las ventajas de esta técnica incluyen que se obtiene el pico de hierro de la molécula, que los experimentos se pueden llevar a cabo con pequeñas cantidades de material para aplicaciones in vitro y que el protocolo se puede lograr con un entrenamiento mínimo.
La metodología descrita se puede aplicar ampliamente para estudiar procesos que involucran ADN, ARN o proteínas. Los ejemplos incluyen transformaciones bioquímicas como información cruzada, identificación de modificaciones químicas u otras interacciones y reactividad de biopolímeros. Una dificultad puede ocurrir por la accesibilidad a un espectrómetro MALDI o a las instalaciones centrales que ofrecen este servicio.
Otro aspecto es establecer el límite de detección que puede ser mayor o menor dependiendo del instrumento. Para comenzar, encienda el espectrofotómetro UV-Vis, luego haga clic en el icono PerkinElmer UV WinLab para abrir la ventana de control de operación del instrumento. Encienda el espectrofotómetro del controlador de temperatura Peltier con el interruptor situado a la derecha del instrumento y haga clic en Scan-Lambda 365, presente en Métodos base.
Se abrirá otra pantalla y se le pedirá al usuario que se asegure de que los soportes de las celdas estén vacíos. Haga clic en Aceptar y permita que el instrumento realice las comprobaciones del sistema. Ahora, ajuste los parámetros de escaneo seleccionando Recopilación de datos.
En la nueva ventana, en Configuración de escaneo, cambie el inicio a 350 nanómetros y el final a 215 nanómetros. Activa el Peltier seleccionando el plus a la izquierda del accesorio. Luego haga clic en Multiple Cell Peltier, cambie los grados de temperatura Celsius a 25 y haga clic en Peltier On.Navegue a la pestaña de información de muestra e ingrese el número de muestras, nombres y posición de celda deseados.
Haga clic en Autozero e inserte la cubeta que contiene la solución de fondo. Haga clic en Inicio e inserte la cubeta en la celda deseada y asegúrese de que la ventana de la cubeta esté orientada paralelamente a la cara frontal del instrumento. Ahora, haga clic en Aceptar para comenzar el primer escaneo a 25 grados centígrados.
Para mediciones a temperaturas más altas, haga clic en Multiple Cell Peltier, cambie la temperatura a la temperatura de muestra deseada y repita el escaneo. Haga clic en Archivo, Exportar y elija la ubicación del archivo deseado y seleccione XY Data para obtener un archivo de texto. Para realizar la fosforilación de 5'de ARN, prepare una solución en un tubo de micro centrífuga de 0,6 microlitros agregando agua libre de RNasa de 33,5 microlitros, cinco microlitros de solución A, seis microlitos de trifosfato de adenosina milimolar de 10 milimolares, una microlita de solución acuosa de ARN micromolar y 4,5 microlitros de polinucleótido quinasa y mezcle la solución suavemente.
Incubar la mezcla de reacción a 37 grados centígrados durante 45 minutos colocándola en un baño de agua. Luego inactivando la enzima colocando el tubo de reacción en un bloque de calor, precalentado a 65 grados centígrados durante 10 minutos. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente para producir una solución final de ARN fosforilado de 5'.
Después de la incubación, use 50 microlitros de esta solución, agregue cinco microlitros de solución B y cinco microlitros de solución de 1-fetomole de Xrn-1 para realizar la hidrólisis de ARN. Incubar el tubo de reacción a temperatura ambiente durante dos horas. Transfiera esta mezcla de reacción a un dispositivo centrífugo del tamaño de un poro de 10 kilodalton y filtre las enzimas centrifugando durante 10 minutos a 700 veces G.Transfiera el filtrado a un tubo centrífugo de 0,6 mililitros.
Luego, agregue 20 microlitros de agua libre de RNasa para lavar el ARN residual en el tubo centrífugo, seguido de centrifugación. Finalmente, combine este filtrado con el filtrado resultante obtenido previamente por centrifugación en un dispositivo centrífugo de 10 kilodaltons del tamaño de un poro, y congele la solución a cero grados Celsius o envíela para su análisis. Para desalinizar y concentrar la muestra, utilice puntas de pipeta C18 de intercambio catiónico disponibles comercialmente cargadas con un lecho de medios de cromatografía C18 en su extremo.
Para esto, coloque la punta de pipeta de 10 microlitros sobre una pipeta de 10 microlitros y lave esta punta dos veces con una solución acuosa de acetilnilo al 50%. Deseche los volúmenes utilizados en un tubo de desecho separado cada vez y equilibre la punta C18 con 10 microlitros de solución de ácido trifluoroacético acuoso al 0,1% dos veces. Retire manualmente la punta C18 de la pipeta y asegúrela en una pipeta de 200 microlitros que contenga una punta de pipeta P200.
Luego sumerja la punta C18 en la solución resultante preparada durante la hidrólisis de oligonucleótidos de ARN por Xrn-1 y aspire liberar la solución a través de la punta C18 10 veces. Ahora, separe la punta C18 de la pipeta P200, colóquela en una pipeta de 10 microlitros y lave la punta C18 con una solución acuosa de solución de ácido trifluoroacético al 0,1% dos veces. Deseche los volúmenes usados en un tubo de desecho separado cada vez.
Lave la punta C18 con agua libre de RNasa de 10 microlitros dos veces. Para detectar en la placa MALDI, eluya el oligonucleótido de ARN de la punta C18 sumergiendo la muestra en la matriz deseada y dispensando la solución de nuevo en el tubo 10 veces. Pipetee esta solución en dos puntos separados de un microlitro cada uno en la placa y permita que los puntos se sequen al aire.
La concentración de ARN utilizada en este trabajo se determinó mediante espectroscopia UV-Visible registrada a 90 grados centígrados para evitar lecturas erróneas derivadas de la formación potencial de las estructuras secundarias. La secuencia general de eventos incluyó dos partes. Uno, la eficiente fosforilación 5' del ARN, evidenciada por la aparición de un solo pico correspondiente al producto esperado.
Y dos, el fragmento de estancamiento que surge del tratamiento de la mezcla de muestra con Xrn-1. Los mismos resultados se obtuvieron utilizando una secuencia diferente que contenía dos lesiones oxidativas. Los cambios potenciales a considerar incluyen la eliminación del uso del dispositivo de filtrado o la consideración de diferentes matrices para el manchado MALDI.
Por ejemplo, ácido sinapínico o ácido picolínico. Los fragmentos de ARN se obtuvieron a partir de un proceso enzimático. Este proceso se estableció mediante el acoplamiento maldi, el análisis electroforético, la síntesis en fase sólida y el dicroísmo circular.
El protocolo descrito tiene un potencial para ser utilizado en diversos campos, desde la investigación en las ciencias químicas hasta las aplicaciones en el campo biomédico.
