질량 분광법은 다양한 응용을 위해 널리 채택되어 왔다. 이 기사의 방법론은 시험관내 효소 공정으로부터 수득된 RNA 단편의 명확한 특성화를 제공한다. 이 기술의 장점은 분자 철 피크가 얻어지고, 실험이 시험관내 응용을 위해 소량의 물질로 수행될 수 있고, 프로토콜이 최소한의 훈련으로 달성될 수 있다는 것을 포함한다.
기술된 방법론은 DNA, RNA 또는 단백질을 포함하는 연구 과정에 널리 적용될 수 있다. 예에는 교차 정보, 화학적 변형의 확인, 또는 다른 생체중합체 상호작용 및 반응성과 같은 생화학적 변형이 포함된다. 이 서비스를 제공하는 MALDI 분광계 또는 핵심 시설에 대한 접근성에서 한 가지 어려움이 발생할 수 있습니다.
또 다른 측면은 계측기에 따라 더 높거나 낮을 수있는 감지 한계를 설정하는 것입니다. 시작하려면 UV-Vis 분광 광도계를 켠 다음 PerkinElmer UV WinLab 아이콘을 클릭하여 기기 작동 제어 창을 엽니 다. 계측기 오른쪽에 있는 스위치를 사용하여 Peltier 온도 컨트롤러 분광광도계를 켜고 기본 방법 아래에 있는 Scan-Lambda 365를 클릭합니다.
다른 화면이 열리고 사용자에게 셀 홀더가 비어 있는지 확인하라는 메시지가 표시됩니다. 확인을 클릭하고 계측기가 시스템 검사를 수행하도록 허용합니다. 이제 데이터 수집을 선택하여 스캔 매개 변수를 조정하십시오.
스캔 설정 아래의 새 창에서 시작을 350나노미터로, 끝을 215나노미터로 변경합니다. 액세서리 왼쪽에 있는 플러스를 선택하여 펠티에를 활성화합니다. 그런 다음 다중 셀 펠티에를 클릭하고 온도를 섭씨 온도도 25로 변경한 다음 펠티에 온을 클릭합니다.샘플 정보 탭으로 이동하여 원하는 샘플, 이름 및 셀 위치를 입력합니다.
Autozero를 클릭하고 배경 솔루션이 들어있는 큐벳을 삽입하십시오. 시작을 클릭하고 원하는 셀에 큐벳을 삽입하고 큐벳 창이 계측기의 앞면과 평행하게 향하도록 합니다. 이제 확인을 클릭하여 섭씨 25도에서 첫 번째 스캔을 시작합니다.
더 높은 온도에서 측정하려면 다중 셀 펠티에를 클릭하고 온도를 원하는 샘플 온도로 변경한 다음 스캔을 반복하십시오. 파일, 내보내기를 클릭하고 원하는 파일 위치를 선택하고 XY 데이터를 선택하여 텍스트 파일을 가져옵니다. RNA의 5' 인산화를 수행하기 위해, 33.5-마이크로리터의 RNase-free 물, 5마이크로리터의 용액 A, 10 밀리몰의 아데노신 트리포스페이트의 6마이크로라이트, 200 마이크로몰의 RNA 수용액 1개, 및 4.5-마이크로리터의 폴리뉴클레오티드 키나제를 첨가하여 0.6-마이크로리터 마이크로원심분리 튜브에서 용액을 제조하고, 용액을 부드럽게 혼합한다.
반응 혼합물을 섭씨 37도에서 45분 동안 수조에 위치시켜 인큐베이션한다. 그런 다음 반응 튜브를 열 블록에 넣고 섭씨 65도에서 10 분 동안 예열하여 효소를 불활성화시킵니다. 용액을 실온으로 냉각시켜 최종 5'인산화된 RNA 용액을 수득한다.
인큐베이션 후,이 용액 50 마이크로 리터를 사용하고, 5 마이크로 리터의 용액 B와 Xrn-1의 1-펨토 몰 용액 5 마이크로 리터를 첨가하여 RNA 가수분해를 수행하십시오. 반응 튜브를 실온에서 두 시간 동안 인큐베이션한다. 이 반응 혼합물을 10-킬로달톤 기공 크기의 원심 장치로 옮기고 여액을 0.6 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고 700 배 G.Transfer 에서 10 분 동안 원심분리하여 효소를 여과하십시오.
이어서, 20-마이크로리터의 RNase-free 물을 첨가하여 원심 튜브 상에서 잔류 RNA를 세척한 다음, 원심분리하였다. 마지막으로, 이 여액을 10킬로달톤 공극 크기의 원심 장치에서 원심분리하여 이전에 얻은 결과물 여액과 결합하고, 분석을 위해 용액을 섭씨 영도 또는 선박에서 동결시킨다. 샘플을 탈염하고 농축하려면 시판되는 양이온 교환 C18 피펫 팁에 C18 크로마토그래피 매질의 침대가 로딩된 것을 사용하십시오.
이를 위해 10 마이크로 리터 피펫 팁을 10 마이크로 리터 피펫 위에 놓고 50 % 수성 아세틸 니트릴 용액으로이 팁을 두 번 씻으십시오. 사용 된 부피를 매번 별도의 폐관에 버리고 C18 팁을 0.1 % 트리플루오로 아세트산 수용액 10 마이크로 리터로 두 번 평형화하십시오. 피펫에서 C18 팁을 수동으로 분리하여 P200 피펫 팁이 들어있는 200마이크로리터 피펫에 고정합니다.
그 후 Xrn-1에 의해 RNA의 올리고뉴클레오티드를 가수분해하는 동안 제조된 생성된 용액에 C18 팁을 침지시키고, 흡인물은 C18 팁을 통해 용액을 10회 방출한다. 이제 P200 피펫에서 C18 팁을 분리하고 10 마이크로 리터 피펫으로 내려 놓은 다음 0.1 % 트리플루오로 아세트산 수용액을 사용하여 C18 팁을 두 번 씻습니다. 사용 된 볼륨을 매번 별도의 폐기물 튜브에 버리십시오.
C18 팁을 10 마이크로리터의 RNase가 없는 물로 두 번 세척하십시오. MALDI 플레이트 상에 스팟팅을 위해, 샘플을 원하는 매트릭스에 침지시키고 용액을 다시 튜브 내로 10회 분주함으로써 C18 팁으로부터 RNA 올리고뉴클레오티드를 용출시킨다. 이 용액을 플레이트에 각각 하나의 마이크로 리터의 두 개의 분리 된 지점에 피펫을 꺼내어 반점이 공기 건조되도록하십시오.
이 작업에 사용 된 RNA의 농도는 이차 구조의 잠재적 인 형성으로 인해 발생하는 잘못된 판독을 피하기 위해 섭씨 90도에서 기록 된 UV-Visible 분광법을 통해 결정되었습니다. 전체 이벤트 시퀀스에는 두 부분이 포함되었습니다. 하나, RNA의 효율적인 5' 인산화는, 예상 생성물에 상응하는 단 하나의 피크의 출현에 의해 입증된다.
및 두 번째로, 샘플 혼합물을 Xrn-1로 처리한 것으로부터 발생하는 실속 단편이다. 동일한 결과가 두 개의 산화성 병변을 포함하는 상이한 서열을 사용하여 수득되었다. 고려해야 할 잠재적 변경에는 필터링 장치의 사용을 제거하거나 MALDI 스포팅을 위한 다른 매트릭스를 고려하는 것이 포함됩니다.
예를 들어, 시나핀산 또는 피콜린산. RNA 단편을 효소적 과정으로부터 수득하였다. 이 과정은 결합 MALDI, 전기 영동 분석, 고상 합성 및 원형 이색성에 의해 확립되었다.
기술된 프로토콜은 화학 과학 연구에서부터 생물 의학 분야의 응용에 이르기까지 다양한 분야에서 사용될 수 있는 잠재력을 갖는다.
