質量分析法は、様々な用途に広く採用されている。この記事の方法論は、in vitro酵素プロセスから得られたRNA断片の明確な特性評価を提供します。この技術の利点には、分子鉄ピークが得られること、in vitro適用のために少量の材料で実験を行うことができること、およびプロトコルを最小限のトレーニングで達成できることが含まれる。
記載された方法論は、DNA、RNA、またはタンパク質を含むプロセスの研究に広く適用することができる。例としては、交差情報などの生化学的変換、化学修飾の同定、または他の生体高分子相互作用および反応性が挙げられる。1つの困難は、MALDI分光計またはこのサービスを提供するコア施設へのアクセスから発生する可能性があります。
別の態様は、機器に応じて高くても低くてもよい検出限界を確立することである。まず、UV-Vis分光光度計をオンにし、PerkinElmer UV WinLabアイコンをクリックして機器操作制御ウィンドウを開きます。機器の右側にあるスイッチを使用してペルチェ温度コントローラ分光光度計をオンにし、[基本メソッド]の下にあるScan-Lambda 365をクリックします。
別の画面が開き、セルホルダーが空であることを確認するようにユーザーに求めます。OKをクリックし、計測器がシステムチェックを実行できるようにします。次に、[データ収集]を選択してスキャンパラメータを調整します。
[スキャン設定] の下の新しいウィンドウで、開始を 350 ナノメートルに、終了を 215 ナノメートルに変更します。アクセサリーの左側にあるプラスを選択してペルチェをアクティブにします。次に、複数セルペルチェをクリックし、温度を摂氏25度に変更し、ペルチェオンをクリックします。サンプル情報タブに移動し、必要なサンプル数、名前、セル位置を入力します。
オートゼロをクリックし、背景溶液を含むキュベットを挿入します。「スタート」をクリックし、キュベットを目的のセルに挿入し、キュベットウィンドウが器具の前面と平行に向いていることを確認します。次に、[OK]をクリックして、最初のスキャンを摂氏25度で開始します。
より高い温度での測定の場合は、マルチセルペルチェをクリックし、温度を目的のサンプル温度に変更してスキャンを繰り返します。[ファイル]、[エクスポート]の順にクリックし、目的のファイルの場所を選択し、[XY Data]を選択してテキストファイルを取得します。RNAの5'リン酸化を行うには、33.5マイクロリットルのRNase非含有水、5マイクロリットルの溶液A、10ミリモルのアデノシン三リン酸6マイクロライト、200マイクロモルRNA水溶液の1マイクロライト、および4.5マイクロリットルのポリヌクレオチドキナーゼを加えて、0.6マイクロリットルのマイクロ遠心管に溶液を調製し、溶液を穏やかに混合する。
反応混合物を摂氏37度で45分間インキュベートし、それを水浴に入れる。その後、反応管をヒートブロックに入れ、摂氏65度で10分間予熱して酵素を失活させた。溶液を室温まで冷却し、最終的な5'リン酸化RNA溶液を得る。
インキュベーション後、50マイクロリットルのこの溶液を使用し、5マイクロリットルの溶液B、および5マイクロリットルのXrn−1の1−フェムトモール溶液を加えてRNA加水分解を行う。反応管を室温で2時間インキュベートする。この反応混合物を10キロダルトン細孔サイズの遠心装置に移し、濾液を0.6ミリリットルの遠沈管に移し、700倍Gで10分間遠心分離することにより酵素をろ過する。
次いで、20マイクロリットルのRNase非含有水を加えて遠心管上の残留RNAを洗浄し、遠心分離を行った。最後に、この濾液を、10キロダルトンの細孔サイズの遠心装置で遠心分離によって以前に得られた濾液と結合し、分析のために溶液を摂氏0度または船で凍結する。サンプルを脱塩および濃縮するには、市販の陽イオン交換 C18 ピペットチップを使用して、その末端に C18 クロマトグラフィー媒体のベッドをロードします。
このために、10マイクロリットルのピペットチップを10マイクロリットルのピペットの上に置き、このチップを50%アセチルニトリル水溶液で2回洗浄する。毎回使用済み容量を別々の廃管に廃棄し、C18チップを10マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸水溶液で2回平衡化します。C18チップをピペットから手動で取り外し、P200ピペットチップが入った200マイクロリットルのピペットに固定します。
次いで、Xrn-1によるRNAのオリゴヌクレオチドの加水分解中に調製した溶液にC18チップを浸漬し、C18チップを介して溶液を10回吸引放出する。次に、C18チップをP200ピペットから取り外し、10マイクロリットルのピペットに下ろし、0.1%トリフルオロ酢酸溶液の水溶液を使用してC18チップを2回洗浄します。使用済みの容量は、毎回別の廃管に廃棄してください。
C18チップを10マイクロリットルのRNaseフリーの水で2回洗浄します。MALDIプレート上にスポッティングするために、サンプルを所望のマトリックスに浸漬し、溶液をチューブに10回分注することによって、C18チップからRNAオリゴヌクレオチドを溶出させる。この溶液をプレート上のそれぞれ1マイクロリットルの2つの別々のスポットにピペットで出し、スポットを風乾させます。
この研究で使用されたRNAの濃度は、二次構造の潜在的な形成から生じる誤った読み取りを避けるために、摂氏90度で記録されたUV可視分光法によって決定された。イベントの全体的なシーケンスには、2 つの部分が含まれていました。一つは、RNAの効率的な5'リン酸化が、予想される産物に対応する1つのピークのみの出現によって証明される。
そして2つは、Xrn−1によるサンプル混合物の処理から生じる失速断片である。2つの酸化病変を含む異なる配列を用いて同じ結果が得られた。考慮すべき潜在的な変更には、フィルタリング装置の使用を排除すること、またはMALDIスポッティングのための異なる行列を考慮することが含まれる。
例えば、シナピン酸やピコリン酸が挙げられる。RNA断片を酵素プロセスから得た。このプロセスは、MALDIを結合させることによって確立され、電気泳動分析、固相合成、および円二色性。
記載されたプロトコルは、化学科学の研究から生物医学分野での応用まで、さまざまな分野で使用される可能性を秘めています。
