Масс-спектрометрия широко используется для различных применений. Методика в данной статье обеспечивает однозначную характеристику фрагментов РНК, полученных в результате ферментативного процесса in vitro. Преимущества этого метода включают в себя то, что достигается пик молекулы железа, что эксперименты могут быть проведены с небольшими количествами материала для применения in vitro, и что протокол может быть выполнен с минимальной подготовкой.
Описанная методика может быть широко применена для изучения процессов с участием ДНК, РНК или белков. Примеры включают биохимические превращения, такие как перекрестная информация, идентификация химических модификаций или другие взаимодействия биополимеров и реакционная способность. Одна из трудностей может возникнуть из-за доступности спектрометра MALDI или основных объектов, которые предлагают эту услугу.
Другим аспектом является установление предела обнаружения, который может быть выше или ниже в зависимости от прибора. Для начала включите спектрофотометр UV-Vis, затем нажмите на значок PerkinElmer UV WinLab, чтобы открыть окно управления работой прибора. Включите спектрофотометр контроллера температуры Пельтье с помощью переключателя, расположенного справа от прибора, и нажмите на Scan-Lambda 365, представленную в разделе «Базовые методы».
Откроется другой экран и пользователю будет предложено убедиться, что держатели ячеек пусты. Нажмите OK и позвольте инструменту проводить системные проверки. Теперь настройте параметры сканирования, выбрав Сбор данных.
В новом окне в разделе Настройки сканирования измените начало на 350 нанометров и конец на 215 нанометров. Активируйте Пельтье, выбрав плюс слева от аксессуара. Затем нажмите на Multiple Cell Peltier, измените температурные градусы Цельсия на 25 и нажмите на Peltier On.Перейдите на вкладку информации о образце и введите желаемое количество образцов, имена и положение ячейки.
Нажмите на Autozero и вставьте кювету, содержащую фоновое решение. Нажмите кнопку Пуск и вставьте кювету в нужную ячейку и убедитесь, что окно кюветы ориентировано параллельно передней грани инструмента. Теперь нажмите кнопку ОК, чтобы начать первое сканирование при температуре 25 градусов по Цельсию.
Для измерений при более высоких температурах нажмите на Multiple Cell Peltier, измените температуру до желаемой температуры образца и повторите сканирование. Нажмите «Файл», «Экспорт», выберите нужное расположение файла и выберите XY Data для получения текстового файла. Для выполнения 5'фосфорилирования РНК готовят раствор в микроцентрифужной трубке объемом 0,6 микролитра, добавляя 33,5 микролитра воды без РНКазы, пять микролитров раствора А, шесть микролитов 10-миллимолярного аденозинтрифосфата, один микролит из 200 микромолярного водного раствора РНК и 4,5 микролитра полинуклеотидкиназы и аккуратно перемешивают раствор.
Инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 45 минут, поместив ее на водяную баню. Затем инактивируют фермент путем помещения реакционной трубки в тепловой блок, предварительно нагретый при 65 градусах Цельсия в течение 10 минут. Дайте раствору остыть до комнатной температуры, чтобы получить окончательный 5'фосфорилированный раствор РНК.
После инкубации используют 50-микролитр этого раствора, добавляют пять микролитров раствора В и пять микролитров 1-фемтомольного раствора Xrn-1 для выполнения гидролиза РНК. Инкубируют реакционную трубку при комнатной температуре в течение двух часов. Переложите эту реакционную смесь на центробежное устройство размером с пору с 10 килодалтонами и фильтруйте ферменты центрифугированием в течение 10 минут при 700кратном G. Перенесите фильтрат в 0,6-миллилитровую центрифужную трубку.
Затем добавьте 20 микролитров рваной воды для промывки остаточной РНК на центробежной трубке с последующим центрифугированием. Наконец, соедините этот фильтрат с полученным фильтратом, полученным ранее центрифугированием в центробежном устройстве размером с пору 10 килодалтонов, и заморозьте раствор при нуле градусов Цельсия или сосуде для анализа. Для обессоливания и концентрирования образца используйте коммерчески доступные катионообменные наконечники пипетки C18, загруженные слоем хроматографической среды C18 на его конце.
Для этого поместите наконечник пипетки объемом 10 микролитра на 10-микролитровую пипетку и дважды промыть этот наконечник 50%-ным водным раствором ацетилнитрила. Каждый раз выбрасывайте использованные объемы в отдельную пробирку для отходов и уравновешивайте наконечник C18 10 микролитрами 0,1% водного раствора трифторуксусной кислоты два раза. Вручную извлеките наконечник C18 из пипетки и закрепите его на 200-микролитровой пипетке, содержащей наконечник пипетки P200.
Затем погружают наконечник С18 в полученный раствор, приготовленный при гидролизе олигонуклеотидов РНК Xrn-1 и аспират высвобождают раствор через наконечник С18 10 раз. Теперь отсоедините наконечник C18 от пипетки P200, поместите его в 10-микролитровую пипетку и промыте наконечник C18, используя водный раствор 0,1% раствора трифторуксусной кислоты дважды. Каждый раз выбрасывайте использованные объемы в отдельную пробирку для отходов.
Два раза вымойте наконечник C18 водой без 10 микролитров. Для обнаружения на пластине MALDI элюируют олигонуклеотид РНК из наконечника C18, погружая образец в нужную матрицу и дозируя раствор обратно в пробирку 10 раз. Выложите этот раствор на два отдельных пятна по одному микролитру каждое на пластине и дайте пятнам высохнуть на воздухе.
Концентрация РНК, использованная в этой работе, была определена с помощью УФ-видимой спектроскопии, зарегистрированной при 90 градусах Цельсия, чтобы избежать ошибочных показаний, возникающих в результате потенциального образования вторичных структур. Общая последовательность событий состояла из двух частей. Во-первых, эффективное 5'фосфорилирование РНК, о чем свидетельствует появление только одного пика, соответствующего ожидаемому продукту.
И второе, фрагмент сваливания, возникающий при обработке образца смеси Xrn-1. Те же результаты были получены с использованием другой последовательности, которая содержала два окислительных поражения. Потенциальные изменения, которые следует рассмотреть, включают отказ от использования фильтрующего устройства или рассмотрение различных матриц для обнаружения MALDI.
Например, синапиновая кислота или пиколиновая кислота. Фрагменты РНК были получены в результате ферментативного процесса. Этот процесс был установлен путем соединения MALDI, электрофоретического анализа, твердофазного синтеза и кругового дихроизма.
Описанный протокол имеет потенциал для использования в различных областях, от исследований в области химических наук до приложений в биомедицинской области.
