Die Massenspektrometrie ist für verschiedene Anwendungen weit verbreitet. Die Methodik in diesem Artikel bietet die eindeutige Charakterisierung von RNA-Fragmenten, die aus einem enzymatischen In-vitro-Prozess gewonnen wurden. Zu den Vorteilen dieser Technik gehört, dass das Molekül Eisenpeak erhalten wird, dass die Experimente mit kleinen Materialmengen für In-vitro-Anwendungen durchgeführt werden können und dass das Protokoll mit minimalem Training durchgeführt werden kann.
Die beschriebene Methodik kann weitgehend auf die Untersuchung von Prozessen mit DNA, RNA oder Proteinen angewendet werden. Beispiele hierfür sind biochemische Umwandlungen wie Kreuzinformation, Identifizierung chemischer Modifikationen oder andere Biopolymerwechselwirkungen und -reaktivitäten. Eine Schwierigkeit kann sich aus der Zugänglichkeit zu einem MALDI-Spektrometer oder Kerneinrichtungen ergeben, die diesen Service anbieten.
Ein weiterer Aspekt ist die Festlegung der Nachweisgrenze, die je nach Gerät höher oder niedriger sein kann. Schalten Sie zunächst das UV-Vis-Spektralphotometer ein und klicken Sie dann auf das PerkinElmer UV WinLab-Symbol, um das Fenster zur Steuerung der Gerätebedienung zu öffnen. Schalten Sie das Spektralphotometer des Peltier-Temperaturreglers mit dem Schalter rechts des Instruments ein und klicken Sie auf Scan-Lambda 365, das unter Basismethoden angezeigt wird.
Ein weiterer Bildschirm wird geöffnet und der Benutzer wird aufgefordert, sicherzustellen, dass die Zellenhalter leer sind. Klicken Sie auf OK und lassen Sie das Gerät seine Systemprüfungen durchführen. Passen Sie nun die Scanparameter an, indem Sie Datenerfassung auswählen.
Ändern Sie im neuen Fenster unter Scaneinstellungen den Anfang auf 350 Nanometer und das Ende auf 215 Nanometer. Aktivieren Sie den Peltier, indem Sie das Plus links neben dem Zubehör auswählen. Klicken Sie dann auf Multiple Cell Peltier, ändern Sie die Temperatur Grad Celsius auf 25 und klicken Sie auf Peltier On.Navigieren Sie zur Registerkarte Probeninfo und geben Sie die Anzahl der gewünschten Proben, Namen und Zellpositionen ein.
Klicken Sie auf AutoNull und legen Sie die Küvette ein, die die Hintergrundlösung enthält. Klicken Sie auf Start und setzen Sie die Küvette in die gewünschte Zelle ein und stellen Sie sicher, dass das Küvettenfenster parallel zur Vorderseite des Instruments ausgerichtet ist. Klicken Sie nun auf OK, um den ersten Scan bei 25 Grad Celsius zu starten.
Für Messungen bei höheren Temperaturen klicken Sie auf Multiple Cell Peltier, ändern Sie die Temperatur auf die gewünschte Probentemperatur und wiederholen Sie das Scannen. Klicken Sie auf Datei, Exportieren und wählen Sie den gewünschten Dateispeicherort und wählen Sie XY-Daten, um eine Textdatei zu erhalten. Um eine 5'Phosphorylierung von RNA durchzuführen, bereiten Sie eine Lösung in einem 0,6-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor, indem Sie 33,5 Mikroliter RNase-freies Wasser, fünf Mikroliter Lösung A, sechs Mikroliter 10 millimolar Adenosintriphosphat, einen Mikrolite von 200 mikromolaren RNA-wässrigen Lösungen und 4,5 Mikroliter Polynukleotidkinase hinzufügen und die Lösung vorsichtig mischen.
Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten, indem Sie es in ein Wasserbad geben. Dann inaktivieren Sie das Enzym, indem Sie das Reaktionsrohr in einen Wärmeblock legen, der bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten vorgewärmt wird. Lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, um eine endgültige 5'phosphorylierte RNA-Lösung zu erhalten.
Verwenden Sie nach der Inkubation 50 Mikroliter dieser Lösung, fügen Sie fünf Mikroliter Lösung B und fünf Mikroliter 1-Femtomollösung von Xrn-1 hinzu, um eine RNA-Hydrolyse durchzuführen. Inkubieren Sie das Reaktionsrohr bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Übertragen Sie diese Reaktionsmischung auf ein porengroßes 10-Kilodalton-Zentrifugalgerät und filtern Sie die Enzyme durch Zentrifugieren für 10 Minuten bei 700 mal G.Geben Sie das Filtrat in ein 0,6-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Dann fügen Sie 20 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu, um die restliche RNA auf dem Zentrifugalröhrchen zu waschen, gefolgt von einer Zentrifugation. Kombinieren Sie schließlich dieses Filtrat mit dem resultierenden Filtrat, das zuvor durch Zentrifugation in einer porengroßen 10-Kilodalton-Zentrifugalvorrichtung erhalten wurde, und frieren Sie die Lösung bei null Grad Celsius ein oder versenden Sie sie zur Analyse. Um die Probe zu entsalzen und zu konzentrieren, verwenden Sie handelsübliche C18-Pipettenspitzen für den Kationenaustausch, die an ihrem Ende mit einem Bett aus C18-Chromatographiemedien beladen sind.
Positionieren Sie dazu die 10-Mikroliter-Pipettenspitze auf einer 10-Mikroliter-Pipette und waschen Sie diese Spitze zweimal mit 50% wässriger Acetylnitrillösung. Entsorgen Sie die verbrauchten Volumina jedes Mal in ein separates Abfallröhrchen und gleichen Sie die C18-Spitze zweimal mit 10 Mikrolitern 0,1% wässriger Trifluoressigsäurelösung aus. Entfernen Sie die C18-Spitze manuell aus der Pipette und befestigen Sie sie auf einer 200-Mikroliter-Pipette mit einer P200-Pipettenspitze.
Dann tauchen Sie die C18-Spitze in die resultierende Lösung ein, die während der Hydrolyse von Oligonukleotiden der RNA durch Xrn-1 hergestellt wurde, und aspirieren Sie die Lösung 10 Mal durch die C18-Spitze. Lösen Sie nun die C18-Spitze von der P200-Pipette, positionieren Sie sie auf eine 10-Mikroliter-Pipette und waschen Sie die C18-Spitze zweimal mit einer wässrigen Lösung von 0,1% Trifluoressigsäurelösung. Entsorgen Sie die verbrauchten Mengen jedes Mal in ein separates Abfallrohr.
Waschen Sie die C18-Spitze zweimal mit 10 Mikrolitern RNase-freiem Wasser. Um die MALDI-Platte zu entdecken, eluieren Sie das RNA-Oligonukleotid aus der C18-Spitze, indem Sie die Probe in die gewünschte Matrix eintauchen und die Lösung 10 Mal wieder in das Röhrchen dosieren. Pipettieren Sie diese Lösung auf zwei separate Spots von je einem Mikroliter auf der Platte und lassen Sie die Spots an der Luft trocknen.
Die Konzentration der in dieser Arbeit verwendeten RNA wurde mittels UV-Visible-Spektroskopie bestimmt, die bei 90 Grad Celsius aufgezeichnet wurde, um fehlerhafte Messwerte zu vermeiden, die sich aus der möglichen Bildung der Sekundärstrukturen ergeben. Die Gesamtabfolge der Ereignisse bestand aus zwei Teilen. Erstens, die effiziente 5'Phosphorylierung von RNA, nachgewiesen durch das Auftreten von nur einem Peak, der dem erwarteten Produkt entspricht.
Und zweitens das Stalling-Fragment, das sich aus der Behandlung der Probenmischung mit Xrn-1 ergibt. Die gleichen Ergebnisse wurden mit einer anderen Sequenz erzielt, die zwei oxidative Läsionen enthielt. Zu den möglichen Änderungen, die in Betracht gezogen werden sollten, gehören die Eliminierung der Verwendung des Filtergeräts oder die Berücksichtigung verschiedener Matrizen für MALDI-Flecken.
Zum Beispiel Sinapinsäure oder Picolinsäure. Die RNA-Fragmente wurden aus einem enzymatischen Prozess gewonnen. Dieser Prozess wurde durch Kopplung von MALDI, elektrophoretischer Analyse, Festphasensynthese und Zirkulardichroismus etabliert.
Das beschriebene Protokoll hat das Potenzial, in verschiedenen Bereichen eingesetzt zu werden, von der Forschung in den chemischen Wissenschaften bis hin zu Anwendungen im biomedizinischen Bereich.
