Kütle spektrometresi çeşitli uygulamalar için yaygın olarak benimsenmiştir. Bu makaledeki metodoloji, in vitro enzimatik bir süreçten elde edilen RNA fragmanlarının kesin karakterizasyonunu sunmaktadır. Bu tekniğin avantajları, molekül demir zirvesinin elde edilmesi, deneylerin in vitro uygulamalar için az miktarda malzeme ile gerçekleştirilebilmesi ve protokolün minimum eğitimle gerçekleştirilebilmesidir.
Açıklanan metodoloji, DNA, RNA veya proteinleri içeren çalışma süreçlerine yaygın olarak uygulanabilir. Örnekler arasında çapraz bilgi, kimyasal modifikasyonların tanımlanması veya diğer biyopolimer etkileşimleri ve reaktivitesi gibi biyokimyasal dönüşümler sayılabilir. Bir MALDI spektrometresine veya bu hizmeti sunan temel tesislere erişilebilirlikten bir zorluk ortaya çıkabilir.
Diğer bir husus, cihaza bağlı olarak daha yüksek veya daha düşük olabilecek algılama sınırının belirlenmesidir. Başlamak için UV-Vis spektrofotometresini açın, ardından PerkinElmer UV WinLab simgesine tıklayarak cihazın çalışma kontrol penceresini açın. Cihazın sağında bulunan anahtarı kullanarak Peltier sıcaklık kontrolörü spektrofotometresini açın ve Temel Yöntemler altında bulunan Scan-Lambda 365'e tıklayın.
Başka bir ekran açılır ve kullanıcıdan hücre tutucuların boş olduğundan emin olmasını ister. Tamam'a tıklayın ve cihazın sistem kontrollerini yapmasına izin verin. Şimdi, Veri Toplama'yı seçerek tarama parametrelerini ayarlayın.
Tarama Ayarları altındaki yeni pencerede, başlangıcı 350 nanometre ve bitişi 215 nanometre olarak değiştirin. Aksesuarın solundaki artıyı seçerek Peltier'i etkinleştirin. Ardından Çoklu Hücre Peltier'e tıklayın, sıcaklık derecelerini 25 olarak değiştirin ve Peltier On.Örnek bilgi sekmesine gidin ve istenen örneklerin, adların ve hücre konumunun sayısını girin.
Autozero'ya tıklayın ve arka plan çözümünü içeren küveti yerleştirin. Başlat'a tıklayın ve küveti istediğiniz hücreye yerleştirin ve küvet penceresinin cihazın ön yüzüne paralel olarak yönlendirildiğinden emin olun. Şimdi, tıklayın OK ilk taramaya 25 santigrat derecede başlamak için.
Daha yüksek sıcaklıklardaki ölçümler için, Çoklu Hücreli Peltier'e tıklayın, sıcaklığı istenen numune sıcaklığına değiştirin ve taramayı tekrarlayın. Dosya, Dışa Aktar'a tıklayın ve istediğiniz dosya konumunu seçin ve bir metin dosyası elde etmek için XY Verisi'ni seçin. RNA'nın 5'fosforilasyonunu gerçekleştirmek için, 33.5 mikrolitre RNaz içermeyen su, beş mikrolitre çözelti A, altı mikrolit 10 milimolar adenozin trifosfat, 200 mikromolar RNA sulu çözeltisinin bir mikroliti ve 4.5 mikrolitre polinükleotid kinaz ekleyerek 0.6 mikrolitrelik bir mikro santrifüj tüpünde bir çözelti hazırlayın ve çözeltiyi nazikçe karıştırın.
Reaksiyon karışımını bir su banyosuna yerleştirerek 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, reaksiyon tüpünü 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna yerleştirerek enzimi inaktive etmek. Son 5'fosforile RNA çözeltisini elde etmek için çözeltinin oda sıcaklığına soğumasına izin verin.
Kuluçkadan sonra, bu çözeltinin 50 mikrolitresini kullanın, RNA hidrolizini gerçekleştirmek için beş mikrolitre B çözeltisi ve beş mikrolitre 1-femtomol Xrn-1 çözeltisi ekleyin. Reaksiyon tüpünü iki saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bu reaksiyon karışımını 10 kilodalton gözenek büyüklüğünde bir santrifüj cihazına aktarın ve 700 kez 10 dakika boyunca santrifüj yaparak enzimleri filtreleyin G.Filtratın 0,6 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.
Daha sonra, santrifüj tüpü üzerindeki artık RNA'yı yıkamak için 20 mikrolitre RNaz içermeyen su ekleyin, ardından santrifüjleme yapın. Son olarak, bu filtratı daha önce 10 kilodalton gözenek büyüklüğünde santrifüjleme ile elde edilen filtrat ile birleştirin ve çözeltiyi sıfır santigrat derecede dondurun veya analiz için gemileyin. Numunenin tuzunu almak ve konsantre etmek için, ucunda C18 kromatografi ortamı yatağı yüklü ticari olarak temin edilebilen katyon değişimli C18 pipet uçlarını kullanın.
Bunun için 10 mikrolitrelik pipet ucunu 10 mikrolitrelik bir pipet üzerine yerleştirin ve bu ucu %50 sulu asetil nitril çözeltisi ile iki kez yıkayın. Kullanılan hacimleri her seferinde ayrı bir atık tüpüne atın ve C18 ucunu iki kez 10 mikrolitrelik %0,1 sulu trifloroasetik asit çözeltisi ile dengeleyin. C18 ucunu pipetten manuel olarak çıkarın ve P200 pipet ucu içeren 200 mikrolitrelik bir pipete sabitleyin.
Daha sonra C18 ucunu, RNA'nın oligonükleotidlerinin Xrn-1 tarafından hidrolizi sırasında hazırlanan elde edilen çözeltiye daldırın ve aspirat, çözeltiyi C18 ucundan 10 kez serbest bırakın. Şimdi, C18 ucunu P200 pipetten ayırın, 10 mikrolitrelik bir pipete yerleştirin ve C18 ucunu iki kez %0,1 trifloroasetik asit çözeltisinden oluşan sulu bir çözelti kullanarak yıkayın. Kullanılan hacimleri her seferinde ayrı bir atık tüpüne atın.
C18 ucunu iki kez 10 mikrolitre RNaz içermeyen suyla yıkayın. MALDI plakasına leke yapmak için, RNA oligonükleotidi, numuneyi istenen matrise batırarak ve çözeltiyi 10 kez tekrar tüpe dağıtarak C18 ucundan süzün. Bu çözeltiyi plakadaki her biri bir mikrolitrelik iki ayrı noktaya pipetleyin ve lekelerin havayla kurumasını sağlayın.
Bu çalışmada kullanılan RNA konsantrasyonu, ikincil yapıların potansiyel oluşumundan kaynaklanan hatalı okumaları önlemek için 90 santigrat derecede kaydedilen UV-Visible spektroskopisi ile belirlendi. Olayların genel sırası iki bölümden oluşuyordu. Birincisi, RNA'nın verimli 5'fosforilasyonu, beklenen ürüne karşılık gelen sadece bir zirvenin ortaya çıkmasıyla kanıtlanmıştır.
Ve ikincisi, numune karışımının Xrn-1 ile işlenmesinden kaynaklanan durma parçası. Aynı sonuçlar, iki oksidatif lezyon içeren farklı bir dizi kullanılarak elde edildi. Göz önünde bulundurulması gereken potansiyel değişiklikler, filtreleme cihazının kullanımının ortadan kaldırılmasını veya MALDI lekelenmesi için farklı matrislerin dikkate alınmasını içerir.
Örneğin, sinapinik asit veya pikolinik asit. RNA fragmanları enzimatik bir süreçten elde edildi. Bu süreç, MALDI, elektroforetik analiz, katı faz sentezi ve dairesel dikroizmin birleştirilmesiyle kurulmuştur.
Tanımlanan protokol, kimya bilimlerindeki araştırmalardan biyomedikal alandaki uygulamalara kadar çeşitli alanlarda kullanılma potansiyeline sahiptir.
