تحليل مورفولوجيا المستقيم العضوي (ROMA): اختبار تشخيصي في التليف الكيسي

يمكن ل ROMA التمييز بين الكائنات العضوية من الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي أو بدونه عندما يتم العثور على أقل من طفرات CFTR المسببة للأمراض وعندما يكون فلوريد العرق متوسطا. يمكن إجراء ROMA في جميع الأعمار وبمعدلات مضاعفات منخفضة. التحليل شبه آلي وموحد ويمكن إرسال الخزعات إلى مختبر مركزي لتحليلها.

يمكن أيضا استخدام المواد العضوية المستخدمة في ROMA للوصول إلى فعالية تعديل CFTR ، ويمكن أن تساعد ROMA في قياس درجة استعادة وظيفة CFTR. بعد يوم واحد من الطلاء ، وصمة عار المواد العضوية مع الكالسيوم الأخضر. قم بتدوير اللوحة وإمالتها قليلا مع الغطاء عدة مرات لضمان التوزيع المتجانس للكالسيوم الأخضر في البئر بالكامل.

احتضان اللوحة مرة أخرى ، لمدة 15 إلى 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لضمان تلطيخ جميع المواد العضوية في الآبار. للتركيز على المواد العضوية ، حدد الموضع الأمثل X و Y ، وركز على الكائنات العضوية في كل بئر يدويا ، باستخدام المجهر متحد البؤر. واحفظ هذه المواضع في برنامج التصوير.

بعد ذلك ، باستخدام إعدادات التصوير بالخلايا الحية ، اضبط الانبعاث على 488 نانومتر والإثارة عند 515 نانومتر ، وهدف تكبير LD عند 5X. للحصول على صور عضوية ، التقط صورا بطريقة اتجاهية موحدة بدقة 1024 بكسل × 1024 بكسل ، وعمق 16 بت باستخدام المجهر متحد البؤر. اختر شدة الليزر والكسب الرئيسي للتصور الأمثل للاختلافات المورفولوجية بين التليف الكيسي وعضويات التليف غير الكيسي.

ابدأ التجربة لالتقاط الصور. بعد ذلك ، احفظ صورة واحدة لكل بئر لجميع الآبار ال 32 بتنسيق المجهر وقم بتصديرها كملفات TIFF. أولا ، قم بتحميل ملفات TIFF في برنامج تحليل الصور ثم قم بإجراء فحص الجودة الأول بناء على معايير الاستبعاد التي يحددها المشغل.

استبعد مجموعة الصور في حالة وجود العديد من الهياكل أو الحطام المتمايز أو الميت عندما تكون كثافة الطلاء غير كافية ، وعند وجود عدد كبير جدا أو قليل جدا من المواد العضوية ، وفي حالة عدم كفاية توزيع التألق. لإعداد الصور للتحليل ، قم بإنشاء وفتح ملف بيانات شبكة واحد لجميع الصور ال 32 لكل ثقافة عضوية ، مما يتيح التحليل المتزامن لجميع الصور ال 32 لكل موضوع. وأعد معايرة الصور بحيث يتوافق بكسل واحد مع 2.5 × 2.5 ميكرومتر.

بعد ذلك ، حدد الهياكل باستخدام عتبة كثافة أقل تبلغ 4،500 ، وعتبة عليا تبلغ 65،535 ، وإيقاف تشغيل الوظائف السلسة والنظيفة ، وتشغيل وظيفة فتحات التعبئة ، ووضع الوظيفة المنفصلة عند 3X. لحساب المواد العضوية ، حدد جميع الهياكل التي تزيد عن أو تساوي 40 ميكرومتر. بعد ذلك ، انقر فوق زر تحديث قياس ND ، وسيتم ترقيم المواد العضوية المحسوبة.

لقياس الكثافة والدائرية للحساب ، حدد جميع الهياكل التي تزيد عن أو تساوي 60 ميكرومتر والعد. بعد ذلك ، قم بإزالة جميع الهياكل التي تلامس حدود الصورة. بعد ذلك ، قم بتآكل بكسل واحد من حدود كل منها ، أكثر من أو يساوي 60 ميكرومتر ، وقياس متوسط شدة كل هيكل.

بعد ذلك ، حدد جميع الهياكل التي تزيد عن أو تساوي 60 ميكرومترا مرة أخرى ، وقم بتآكل 10 بكسل من حدود كل منها ، أكثر من أو تساوي بنية 60 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بقياس متوسط شدة كل هيكل متآكل ودائرية كل هيكل. بعد ذلك ، احسب نسبة الشدة بقسمة قياس الشدة بعد تآكل 25 ميكرومتر من حدود كل منها ، أكثر من أو تساوي بنية 60 ميكرومتر على متوسط قياس الكثافة بعد تآكل 2.5 ميكرومتر من حدود كل منها ، أكثر من أو تساوي بنية 60 ميكرومتر.

قم بإجراء فحص الجودة الثاني بناء على معايير الاستبعاد التي يحددها البرنامج كما هو موضح في المخطوطة. تم جمع وتصوير المواد العضوية من 212 شخصا. بعد استبعاد 23 مجموعة من الصور ، تم تحليل الصور العضوية من 167 شخصا مصابا بالتليف الكيسي ومرضين يسببان طفرات CFTR ومن 22 شخصا غير مصاب بالتليف الكيسي ، تم العثور على متوسط عدد المواد العضوية لكل مزرعة ليكون 1،519.

تم تحديد نسبة الشدة ومؤشر الدائرية للعضويات من الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي وبدونه. باستخدام هذين المؤشرين ، تم الحصول على تمييز مثالي بين الكائنات العضوية من الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي وبدونه ، ليس فقط عند استخدام البيانات من جميع الآبار ال 32 ، ولكن أيضا عندما تم اختيار ثمانية آبار بشكل عشوائي لكل ثقافة. تم الحصول على الرسوم البيانية لأربع ثقافات توضيحية ، توضح توزيع قيم الدائرية ، وشدة الجزء المركزي من العضو العضوي ، وشدة العضو العضوي بأكمله.

تعد مراقبة الجودة أمرا ضروريا ، حيث أن الصور عالية الجودة مطلوبة للحساب الدقيق لنسبة الكثافة ومؤشر الدائرية. يمكن أيضا استخدام الثقافات العضوية التي تم إنشاؤها ل ROMA للمساعدات الفيزيائية لاختبار تأثير علاج CFTR. يمكن استخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين لمزيد من توصيف متغيرات CFTR.