ROMA puede discriminar entre organoides de sujetos con y sin fibrosis quística cuando se encuentran menos de dos mutaciones CFTR causantes de enfermedades y cuando el fluoruro en sudor es intermedio. ROMA se puede realizar en todas las edades y con bajas tasas de complicaciones. El análisis es semiautomatizado y estandarizado y las biopsias se pueden enviar a un laboratorio central para su análisis.
Los organoides utilizados para ROMA también se pueden usar para acceder a la eficacia moduladora de CFTR, y ROMA podría ayudar a medir el grado de restauración de la función de CFTR. Un día después del emplatado, tiñe los organoides con verde calcio. Gire e incline ligeramente la placa con la tapa puesta varias veces para garantizar una distribución homogénea del verde calcio en todo el pozo.
Incubar la placa nuevamente, durante 15 a 30 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para asegurar la tinción de todos los organoides en los pozos. Para enfocar los organoides, determine la posición óptima X e Y, y concéntrese en los organoides en cada pocillo manualmente, usando el microscopio confocal. Y guarde estas posiciones en el software de imágenes.
A continuación, utilizando la configuración de imágenes de células vivas, establezca la emisión en 488 nanómetros y la excitación en 515 nanómetros, y un objetivo de aumento LD en 5X. Para adquirir imágenes organoides, tome imágenes de forma direccional unitaria con una resolución de 1024 píxeles por 1024 píxeles, y una profundidad de 16 bits con el microscopio confocal. Elija la intensidad del láser y la ganancia maestra para una visualización óptima de las diferencias morfológicas entre los organoides de fibrosis quística y los organoides de fibrosis no quística.
Inicie el experimento para capturar las imágenes. Después, guarde una imagen por pocillo para los 32 pocillos en formato de microscopio y expórtelos como archivos TIFF. Primero, cargue los archivos TIFF en el software de análisis de imágenes y luego realice el primer control de calidad basado en los criterios de exclusión determinados por el operador.
Excluir el conjunto de imágenes si hay muchas estructuras o escombros diferenciados o muertos cuando la densidad del recubrimiento es inadecuada, cuando hay demasiados o muy pocos organoides y en caso de distribución inadecuada de la fluorescencia. Para preparar las imágenes para el análisis, cree y abra un archivo de datos de red de las 32 imágenes para cada cultivo de organoide, lo que permite el análisis simultáneo de las 32 imágenes por sujeto. Y recalibre las imágenes para que un píxel corresponda a 2,5 por 2,5 micrómetros.
Luego, delinee las estructuras usando un umbral de intensidad más bajo de 4, 500 y un umbral superior de 65, 535, apagando las funciones lisas y limpias, activando la función de orificios de relleno y poniendo la función separada en 3X. Para contar los organoides, seleccione todas las estructuras mayores o iguales a 40 micrómetros. A continuación, haga clic en el botón de actualización de medición ND y los organoides contados se numerarán.
Para medir la intensidad y la circularidad para el cálculo, seleccione todas las estructuras mayores o iguales a 60 micrómetros y cuente. Luego, retire todas las estructuras que tocan los bordes de la imagen. A continuación, erosione un píxel del borde de cada estructura, más o igual a 60 micrómetros, y mida la intensidad media de cada estructura.
Después, seleccione todas las estructuras mayores o iguales a 60 micrómetros de nuevo, y erosione 10 píxeles del borde de cada estructura, más o igual a 60 micrómetros. Luego, mide la intensidad media de cada estructura erosionada y la circularidad de cada estructura. Luego, calcule la relación de intensidad dividiendo la medición de intensidad después de erosionar 25 micrómetros del borde de cada estructura de más o igual a 60 micrómetros por la media de la medición de intensidad después de erosionar 2.5 micrómetros del borde de cada estructura, más o igual a 60 micrómetros.
Realice el segundo control de calidad basado en criterios de exclusión determinados por el software como se describe en el manuscrito. Se recolectaron organoides de 212 sujetos y se obtuvieron imágenes. Después de la exclusión de 23 conjuntos de imágenes, se analizaron imágenes organoides de 167 sujetos con fibrosis quística y dos mutaciones CFTR causantes de enfermedad y de 22 sujetos con fibrosis no quística, se encontró que el número medio de organoides por cultivo era 1, 519.
La relación de intensidad y el índice de circularidad se determinaron para organoides de sujetos con y sin fibrosis quística. Usando estos dos índices, se obtuvo una discriminación perfecta entre organoides de sujetos con y sin fibrosis quística, no solo cuando se utilizaron datos de los 32 pocillos, sino también cuando se eligieron ocho pocillos al azar para cada cultivo. Se obtuvieron histogramas para cuatro cultivos ilustrativos, mostrando la distribución de valores para la circularidad, la intensidad de la parte central del organoide y la intensidad de todo el organoide.
El control de calidad es esencial, ya que se requieren imágenes de alta calidad para un cálculo preciso de la relación de intensidad y el índice de circularidad. Los cultivos de organoides establecidos para ROMA también se pueden usar como ayudas físicas para probar el efecto del tratamiento con CFTR. El ARN, el ADN y la proteína se pueden extraer para una mayor caracterización de las variantes de CFTR.
