ROMA может различать органоиды от субъектов с муковисцидозом и без него, когда обнаружено менее двух болезнетворных мутаций CFTR и когда фторид пота является промежуточным. ROMA может быть выполнен в любом возрасте и с низкой частотой осложнений. Анализ является полуавтоматизированным и стандартизированным, и биопсия может быть отправлена в центральную лабораторию для анализа.
Органоиды, используемые для ROMA, также могут быть использованы для доступа к модуляторной эффективности CFTR, а ROMA может помочь в измерении степени восстановления функции CFTR. Через сутки после нанесения покрытия окрасьте органоиды кальциевым зеленым цветом. Поверните и слегка наклоните пластину с крышкой на несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение кальциевого зеленого во всей лунке.
Снова инкубируйте пластину, в течение 15-30 минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы обеспечить окрашивание всех органоидов в колодцах. Чтобы сосредоточиться на органоидах, определите оптимальное положение X и Y и сосредоточьтесь на органоидах в каждой лунке вручную, используя конфокальный микроскоп. И сохраните эти позиции в программном обеспечении для обработки изображений.
Затем, используя настройки визуализации живых клеток, установите излучение на 488 нанометров и возбуждение на 515 нанометров и объектив увеличения LD на 5X. Чтобы получить органоидные снимки, делайте снимки единичным направленным способом с разрешением 1024 пикселя на 1024 пикселя и глубиной 16 бит с помощью конфокального микроскопа. Выберите интенсивность лазера и мастер-усиление для оптимальной визуализации морфологических различий между органоидами муковисцидоза и нецистинозного фиброза.
Запустите эксперимент для захвата изображений. После этого сохраните одно изображение на скважину для всех 32 скважин в формате микроскопа и экспортируйте их в виде файлов TIFF. Сначала загрузите файлы TIFF в программное обеспечение для анализа изображений, а затем выполните первую проверку качества на основе критериев исключения, определенных оператором.
Исключите набор изображений, если присутствует много дифференцированных или мертвых структур или обломков, когда плотность покрытия недостаточна, когда присутствует слишком много или слишком мало органоидов, и в случае неадекватного распределения флуоресценции. Чтобы подготовить изображения к анализу, создайте и откройте один сетевой файл данных из всех 32 изображений для каждой органоидной культуры, что позволит одновременно анализировать все 32 изображения на субъект. И перекалибруйте изображения так, чтобы один пиксель соответствовал 2,5 на 2,5 микрометра.
Затем очертите структуры, используя более низкий порог интенсивности 4 500 и верхний порог 65 535, отключив функции плавности и очистки, включив функцию заполнения отверстий и поместив отдельную функцию в 3X. Чтобы подсчитать органоиды, выберите все структуры, превышающие или равные 40 микрометрам. Затем нажмите кнопку обновления измерения ND, и подсчитанные органоиды будут пронумерованы.
Чтобы измерить интенсивность и цикличность для расчета, выберите все структуры, превышающие или равные 60 микрометрам, и подсчитайте. Затем удалите все структуры, касающиеся границ картины. Затем размываем один пиксель от границы каждой, более или равной 60-микрометровой структуре, и измеряем среднюю интенсивность каждой структуры.
После этого снова выберите все структуры, превышающие или равные 60 микрометрам, и размывайте 10 пикселей от границы каждой, более или равной структуре 60 микрометров. Затем измерьте среднюю интенсивность каждой эродированной структуры и цикличность каждой структуры. Затем рассчитайте коэффициент интенсивности, разделив измерение интенсивности после эрозии 25 микрометров от границы каждой, более или равной 60 микрометровой структуре на среднее измерение интенсивности после эрозии 2,5 микрометров от границы каждой, более или равной 60 микрометровой структуре.
Выполните вторую проверку качества на основе критериев исключения, определенных программным обеспечением, как описано в рукописи. Органоиды из 212 субъектов были собраны и сфотографированы. После исключения 23 наборов изображений, органоидных изображений от 167 субъектов с муковисцидозом и двумя мутациями CFTR, вызывающими заболевание, и от 22 субъектов, не связанных с муковисцидозом, было обнаружено, что среднее количество органоидов на культуру составляет 1 519.
Соотношение интенсивности и индекс циркулярности были определены для органоидов субъектов с муковисцидозом и без него. Используя эти два индекса, была получена идеальная различение между органоидами от субъектов с муковисцидозом и без него не только при использовании данных из всех 32 скважин, но и когда восемь лунок были выбраны случайным образом для каждой культуры. Получены гистограммы для четырех иллюстративных культур, показывающие распределение значений циркулярности, интенсивности центральной части органоида и интенсивности всего органоида.
Контроль качества имеет важное значение, так как для точного расчета коэффициента интенсивности и индекса цикличности требуются высококачественные снимки. Органоидные культуры, созданные для ROMA, также могут быть использованы для физических пособий для проверки эффекта лечения CFTR. РНК, ДНК и белок могут быть извлечены для дальнейшей характеристики вариантов CFTR.
