A ROMA pode discriminar entre organoides de indivíduos com e sem fibrose cística quando menos de duas mutações CFTR causadoras da doença são encontradas e quando o flúor do suor é intermediário. A ROMA pode ser realizada em todas as idades e com baixas taxas de complicações. A análise é semi-automatizada e padronizada e as biópsias podem ser enviadas para um laboratório central para análise.
Os organoides usados para ROMA também podem ser usados para acessar a eficácia modulatória do CFTR, e a ROMA pode ajudar a medir o grau de restauração da função do CFTR. Um dia após o revestimento, manche os organoides com verde cálcio. Gire e incline ligeiramente a placa com a tampa sobre algumas vezes para garantir a distribuição homogênea do verde cálcio em todo o poço.
Incubar a placa novamente, por 15 a 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para garantir a coloração de todos os organoides nos poços. Para se concentrar nos organoides, determine a posição X e Y ideal e concentre-se nos organoides em cada poço manualmente, usando o microscópio confocal. E salve essas posições no software de imagem.
Em seguida, usando configurações de imagem de células vivas, defina a emissão em 488 nanômetros e a excitação em 515 nanômetros e um objetivo de ampliação LD em 5X. Para adquirir fotos organoides, tire imagens de forma direcional unitária com uma resolução de 1024 pixels por 1024 pixels e uma profundidade de 16 bits com o microscópio confocal. Escolha a intensidade do laser e o ganho mestre para uma visualização ideal das diferenças morfológicas entre organoides de fibrose cística e fibrose não cística.
Inicie o experimento para capturar as imagens. Depois, salve uma imagem por poço para todos os 32 poços no formato de microscópio e exporte-os como arquivos TIFF. Primeiro, carregue os arquivos TIFF no software de análise de imagem e, em seguida, execute a primeira verificação de qualidade com base nos critérios de exclusão determinados pelo operador.
Exclua o conjunto de imagens se muitas estruturas ou detritos diferenciados ou mortos estiverem presentes quando a densidade de revestimento for inadequada, quando muitos ou poucos organoides estiverem presentes e em caso de distribuição inadequada de fluorescência. Para preparar imagens para análise, crie e abra um arquivo de dados de rede de todas as 32 imagens para cada cultura organoide, permitindo a análise simultânea de todas as 32 imagens por assunto. E recalibre as imagens para que um pixel corresponda a 2,5 por 2,5 micrômetros.
Em seguida, delineie as estruturas usando um limiar de intensidade mais baixo de 4, 500 e um limiar superior de 65, 535, desligando as funções lisas e limpas, ativando a função de orifícios de preenchimento e colocando a função separada em 3X. Para contar os organoides, selecione todas as estruturas maiores ou iguais a 40 micrômetros. Em seguida, clique no botão de medição de ND de atualização e os organoides contados serão numerados.
Para medir a intensidade e a circularidade para o cálculo, selecione todas as estruturas maiores ou iguais a 60 micrômetros e conte. Em seguida, remova todas as estruturas que tocam as bordas da imagem. Em seguida, corroa um pixel da borda de cada estrutura, maior ou igual a 60 micrômetros, e meça a intensidade média de cada estrutura.
Depois, selecione todas as estruturas maiores ou iguais a 60 micrômetros novamente e corroa 10 pixels da borda de cada estrutura, mais ou igual a 60 micrômetros. Em seguida, meça a intensidade média de cada estrutura erodida e a circularidade de cada estrutura. Em seguida, calcule a razão de intensidade dividindo a medida de intensidade após erosão de 25 micrômetros da borda de cada estrutura maior ou igual a 60 micrômetros pela média da medição de intensidade após erosão de 2,5 micrômetros da borda de cada estrutura, mais ou igual a 60 micrômetros.
Realizar a segunda verificação de qualidade com base nos critérios de exclusão determinados pelo software, conforme descrito no manuscrito. Organoides de 212 indivíduos foram coletados e fotografados. Após a exclusão de 23 conjuntos de figuras, foram analisadas imagens organoides de 167 indivíduos com fibrose cística e duas doenças causadoras de mutações no CFTR e de 22 indivíduos com fibrose não cística, o número médio de organoides por cultura foi de 1.519.
A razão de intensidade e o índice de circularidade foram determinados para organoides de indivíduos com e sem fibrose cística. Utilizando esses dois índices, obteve-se perfeita discriminação entre organoides de indivíduos com e sem fibrose cística não apenas quando se utilizaram dados de todos os 32 poços, mas também quando oito poços foram escolhidos aleatoriamente para cada cultura. Histogramas para quatro culturas ilustrativas foram obtidos, mostrando a distribuição dos valores de circularidade, a intensidade da parte central do organoide e a intensidade de todo o organoide.
O controle de qualidade é essencial, pois imagens de alta qualidade são necessárias para o cálculo preciso da razão de intensidade e do índice de circularidade. Culturas organoides estabelecidas para ROMA também podem ser usadas para auxílios físicos para testar o efeito do tratamento com CFTR. RNA, DNA e proteína podem ser extraídos para posterior caracterização de variantes de CFTR.
