直肠类器官形态学分析（ROMA）：囊性纤维化的诊断测定

当发现少于两个致病的CFTR突变并且汗液氟化物为中间时，ROMA可以区分类器官与有和没有囊性纤维化的受试者。ROMA可以在所有年龄段进行，并发症发生率低。分析是半自动和标准化的，活检可以送到中心实验室进行分析。

用于ROMA的类器官也可用于获得CFTR调节功效，ROMA可以帮助测量CFTR功能的恢复程度。电镀一天后，用钙绿染色类器官。旋转并稍微倾斜板，盖上盖子几次，以确保钙绿色在整个孔中的均匀分布。

再次孵育板，在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育15至30分钟，以确保孔中所有类器官的染色。要聚焦类器官，请确定最佳X和Y位置，并使用共聚焦显微镜手动聚焦每个孔中的类器官。并将这些位置保存在成像软件中。

接下来，使用活细胞成像设置，将发射设置为488纳米，激发设置为515纳米，LD放大镜设置为5X。要获取类器官图片，请使用共聚焦显微镜以分辨率为1024像素×1024像素、深度为16位的单位方向方式拍摄图像。选择激光强度和主增益，以最佳方式可视化囊性纤维化和非囊性纤维化类器官之间的形态差异。

开始实验以捕获图像。然后，以显微镜格式为所有32个孔保存每孔一张图片，并将其导出为TIFF文件。首先，在图像分析软件中加载TIFF文件，然后根据操作员确定的排除标准执行第一次质量检查。

如果当镀层密度不足时，当存在过多或过少的类器官以及荧光分布不足时，存在许多分化或死结构或碎片，则排除一组图片。要准备用于分析的图像，请为每个类器官培养物创建并打开一个包含所有 32 张图片的网络数据文件，从而可以同时分析每个受试者的所有 32 张图片。并重新校准图像，使一个像素对应于 2.5 x 2.5 微米。

然后，使用较低强度阈值 4， 500 和上限阈值 65， 535 描绘结构，关闭平滑和清洁功能，打开填充孔功能，并将单独的功能置于 3X。要计算类器官，请选择大于或等于40微米的所有结构。接下来，单击更新ND测量按钮，计数的类器官将被编号。

要测量强度和圆度以进行计算，请选择大于或等于 60 微米的所有结构并计数。然后，删除所有接触图片边框的结构。接下来，从每个结构的边界侵蚀一个像素，大于或等于60微米的结构，并测量每个结构的平均强度。

然后，再次选择所有大于或等于60微米的结构，并从每个结构的边界侵蚀10个像素，大于或等于60微米的结构。然后，测量每个侵蚀结构的平均强度和每个结构的圆度。然后，通过将从每个结构的边界侵蚀25微米、大于或等于60微米的结构侵蚀25微米后的强度测量值除以从每个边界侵蚀2.5微米、大于或等于60微米结构后的强度测量值的平均值来计算强度比。

根据手稿中所述的软件确定的排除标准执行第二次质量检查。收集了来自212名受试者的类器官并进行成像。排除23组图片后，分析了167名囊性纤维化和两种引起CFTR突变的疾病的受试者和22名非囊性纤维化受试者的类器官图片，发现每次培养的平均类器官数量为1，519。

确定有和没有囊性纤维化的受试者的类器官的强度比和圆度指数。使用这两个指标，不仅在使用来自所有32个孔的数据时，而且当为每个培养物随机选择8个孔时，都可以对具有和没有囊性纤维化的受试者的类器官进行完美区分。获得了四种说明性培养物的直方图，显示了圆度值的分布、类器官中央部分的强度以及整个类器官的强度。

质量控制至关重要，因为准确计算强度比和圆度指数需要高质量的图片。为ROMA建立的类器官培养物也可用于物理辅助，以测试CFTR治疗的效果。可以提取RNA，DNA和蛋白质，以进一步表征CFTR变体。