ROMA peut faire la distinction entre les organoïdes de sujets atteints et non de mucoviscidose lorsque moins de deux mutations CFTR pathogènes sont trouvées et lorsque le fluorure de sueur est intermédiaire. ROMA peut être effectué à tous les âges et avec de faibles taux de complications. L’analyse est semi-automatisée et standardisée et les biopsies peuvent être envoyées à un laboratoire central pour analyse.
Les organoïdes utilisés pour la ROMA peuvent également être utilisés pour accéder à l’efficacité modulatrice du CFTR, et ROMA pourrait aider à mesurer le degré de restauration de la fonction CFTR. Un jour après le placage, colorer les organoïdes avec du vert de calcium. Faites pivoter et inclinez légèrement la plaque avec le couvercle plusieurs fois pour assurer une répartition homogène du vert de calcium dans l’ensemble du puits.
Incuber à nouveau la plaque, pendant 15 à 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour assurer la coloration de tous les organoïdes dans les puits. Pour vous concentrer sur les organoïdes, déterminez la position optimale X et Y, et concentrez-vous manuellement sur les organoïdes de chaque puits, à l’aide du microscope confocal. Et enregistrez ces positions dans le logiciel d’imagerie.
Ensuite, à l’aide des paramètres d’imagerie de cellules vivantes, définissez l’émission à 488 nanomètres et l’excitation à 515 nanomètres, et un objectif de grossissement LD à 5X. Pour acquérir des images organoïdes, prenez des images de manière unitaire directionnelle avec une résolution de 1024 pixels par 1024 pixels et une profondeur de 16 bits avec le microscope confocal. Choisissez l’intensité laser et le gain principal pour une visualisation optimale des différences morphologiques entre la mucoviscidose et les organoïdes non mucoviscidose.
Démarrez l’expérience pour capturer les images. Ensuite, enregistrez une image par puits pour les 32 puits au format microscope et exportez-les sous forme de fichiers TIFF. Tout d’abord, chargez les fichiers TIFF dans le logiciel d’analyse d’image, puis effectuez le premier contrôle de qualité basé sur des critères d’exclusion déterminés par l’opérateur.
Exclure l’ensemble des images si de nombreuses structures ou débris différenciés ou morts sont présents lorsque la densité de placage est insuffisante, lorsque trop ou trop peu d’organoïdes sont présents et en cas de distribution de fluorescence inadéquate. Pour préparer les images pour l’analyse, créez et ouvrez un fichier de données réseau des 32 images pour chaque culture organoïde, permettant une analyse simultanée des 32 images par sujet. Et recalibrez les images de sorte qu’un pixel corresponde à 2,5 par 2,5 micromètres.
Ensuite, délimitez les structures à l’aide d’un seuil d’intensité inférieur de 4 500 et d’un seuil supérieur de 65 535, en désactivant les fonctions lisse et propre, en activant la fonction de remplissage et en plaçant la fonction séparée à 3X. Pour compter les organoïdes, sélectionnez toutes les structures supérieures ou égales à 40 micromètres. Ensuite, cliquez sur le bouton de mise à jour de la mesure ND et les organoïdes comptés seront numérotés.
Pour mesurer l’intensité et la circularité aux fins du calcul, sélectionnez toutes les structures supérieures ou égales à 60 micromètres et comptez. Ensuite, supprimez toutes les structures touchant les bordures de l’image. Ensuite, érodez un pixel de la bordure de chaque structure, supérieure ou égale à 60 micromètres, et mesurez l’intensité moyenne de chaque structure.
Ensuite, sélectionnez à nouveau toutes les structures supérieures ou égales à 60 micromètres et érodez 10 pixels à partir de la bordure de chaque structure, supérieure ou égale à 60 micromètres. Ensuite, mesurez l’intensité moyenne de chaque structure érodée et la circularité de chaque structure. Ensuite, calculez le rapport d’intensité en divisant la mesure d’intensité après érosion de 25 micromètres de la bordure de chaque structure, supérieure ou égale à 60 micromètres par la moyenne de la mesure d’intensité après érosion de 2,5 micromètres de la bordure de chaque structure, supérieure ou égale à 60 micromètres.
Effectuez le deuxième contrôle de qualité basé sur les critères d’exclusion déterminés par le logiciel comme décrit dans le manuscrit. Les organoïdes de 212 sujets ont été collectés et imagés. Après exclusion de 23 séries d’images, des images organoïdes de 167 sujets atteints de mucoviscidose et de deux maladies causant des mutations CFTR et de 22 sujets non mucoviscico-fibrosiques ont été analysés, le nombre moyen d’organoïdes par culture s’est avéré être de 1 519.
Le rapport d’intensité et l’indice de circularité ont été déterminés pour les organoïdes provenant de sujets atteints et non de mucoviscidose. En utilisant ces deux indices, une discrimination parfaite a été obtenue entre les organoïdes des sujets avec et sans mucoviscidose, non seulement en utilisant les données des 32 puits, mais aussi lorsque huit puits ont été choisis au hasard pour chaque culture. Des histogrammes pour quatre cultures illustratives ont été obtenus, montrant la distribution des valeurs de circularité, l’intensité de la partie centrale de l’organoïde et l’intensité de l’organoïde entier.
Le contrôle de la qualité est essentiel, car des images de haute qualité sont nécessaires pour un calcul précis du rapport d’intensité et de l’indice de circularité. Les cultures organoïdes établies pour le ROMA peuvent également être utilisées comme aides physiques pour tester l’effet du traitement CFTR. L’ARN, l’ADN et les protéines peuvent être extraits pour une caractérisation plus approfondie des variantes du CFTR.
