ניתוח מורפולוגיה אורגנואידית רקטלית (ROMA): בדיקה אבחנתית בסיסטיק פיברוזיס

ROMA יכול להבחין בין אורגנואידים מנבדקים עם ובלי סיסטיק פיברוזיס כאשר נמצאות פחות משתי מוטציות CFTR הגורמות למחלה וכאשר פלואוריד הזיעה הוא בינוני. ניתן לבצע ROMA בכל הגילאים ובשיעורי סיבוכים נמוכים. הניתוח הוא חצי אוטומטי וסטנדרטי וניתן לשלוח ביופסיות למעבדה מרכזית לניתוח.

ניתן להשתמש באורגנואידים המשמשים ל-ROMA גם כדי לגשת ליעילות אפנון CFTR, ו-ROMA יכול לסייע במדידת מידת השיקום של פונקציית CFTR. יום לאחר הציפוי, מכתימים את האורגנואידים בירוק סידן. סובבו והטו מעט את הצלחת עם המכסה כמה פעמים כדי להבטיח פיזור הומוגני של ירוק הסידן בבאר כולה.

דגרו שוב את הצלחת, למשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני כדי להבטיח צביעה של כל האורגנואידים בבארות. כדי להתמקד באורגנואידים, לקבוע את המיקום האופטימלי X ו- Y, ולהתמקד באורגנואידים בכל באר באופן ידני, באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. ולשמור את המיקומים האלה בתוכנת ההדמיה.

לאחר מכן, באמצעות הגדרות הדמיה של תאים חיים, הגדר את הפליטה על 488 ננומטר ואת העירור על 515 ננומטר, ואת יעד הגדלת LD על 5X. כדי לרכוש תמונות אורגנואידיות, צלם תמונות בצורה כיוונית יחידה ברזולוציה של 1024 פיקסלים על 1024 פיקסלים, ועומק של 16 סיביות עם המיקרוסקופ הקונפוקלי. בחר את עוצמת הלייזר ואת רווח האב להדמיה אופטימלית של הבדלים מורפולוגיים בין סיסטיק פיברוזיס לבין אורגנואידים שאינם סיסטיק פיברוזיס.

התחל את הניסוי כדי ללכוד את התמונות. לאחר מכן, שמור תמונה אחת לכל באר עבור כל 32 הבארות בפורמט מיקרוסקופ וייצא אותן כקבצי TIFF. ראשית, טען את קבצי TIFF בתוכנת ניתוח התמונה ולאחר מכן בצע את בדיקת האיכות הראשונה בהתבסס על קריטריוני אי הכללה שנקבעו על ידי המפעיל.

אל תכלול את קבוצת התמונות אם קיימים מבנים או פסולת מובחנים או מתים רבים כאשר צפיפות הציפוי אינה מספקת, כאשר קיימים יותר מדי אורגנואידים או מעט מדי, ובמקרה של התפלגות פלואורסצנטית לא מספקת. כדי להכין תמונות לניתוח, צור ופתח קובץ נתוני רשת אחד של כל 32 התמונות עבור כל תרבות אורגנואידית, המאפשר ניתוח סימולטני של כל 32 התמונות לכל נושא. וכייל מחדש תמונות כך שפיקסל אחד יתאים ל-2.5 על 2.5 מיקרומטר.

לאחר מכן, תיחום מבנים באמצעות סף עוצמה נמוך יותר של 4, 500, וסף עליון של 65, 535, כיבוי הפונקציות החלקות והנקיות, הפעלת פונקציית חורי המילוי, והצבת הפונקציה הנפרדת על פי 3. כדי לספור את האורגנואידים, בחר את כל המבנים יותר או שווה ל 40 מיקרומטר. לאחר מכן, לחץ על כפתור המדידה עדכן ND, והאורגנואידים שנספרו יהיו ממוספרים.

כדי למדוד עוצמה ומעגליות לחישוב, בחר את כל המבנים הגדולים או שווים ל- 60 מיקרומטר וספור. לאחר מכן, הסר את כל המבנים הנוגעים בגבולות התמונה. לאחר מכן, יש לשחוק פיקסל אחד מהגבול של כל אחד מהם, יותר או שווה למבנה של 60 מיקרומטר, ולמדוד את העוצמה הממוצעת של כל מבנה.

לאחר מכן, בחר שוב את כל המבנים הגדולים או שווים ל- 60 מיקרומטר, ושחק 10 פיקסלים מהגבול של כל אחד מהם, יותר או שווה ל- 60 מיקרומטר. לאחר מכן, מדוד את העוצמה הממוצעת של כל מבנה שנשחק ואת המעגליות של כל מבנה. לאחר מכן, חשב את יחס העוצמה על ידי חלוקת מדידת העוצמה לאחר שחיקה של 25 מיקרומטר מהגבול של כל אחד מהם, יותר או שווה למבנה של 60 מיקרומטר בממוצע של מדידת העוצמה לאחר שחיקה של 2.5 מיקרומטר מהגבול של כל אחד מהם, יותר או שווה למבנה של 60 מיקרומטר.

בצע את בדיקת האיכות השנייה בהתבסס על קריטריוני אי-הכללה שנקבעו על-ידי התוכנה כמתואר בכתב היד. אורגנואידים מ-212 נבדקים נאספו וצולמו. לאחר הרחקה של 23 סטים של תמונות, תמונות אורגנואידיות מ-167 נבדקים עם סיסטיק פיברוזיס ושתי מחלות הגורמות למוטציות CFTR ומ-22 נבדקים שאינם סיסטיק פיברוזיס, נמצא כי המספר הממוצע של אורגנואידים לכל תרבית הוא 1, 519.

יחס העוצמה ומדד המעגליות נקבעו עבור אורגנואידים מנבדקים עם ובלי סיסטיק פיברוזיס. באמצעות שני מדדים אלה, התקבלה הבחנה מושלמת בין אורגנואידים מנבדקים עם ובלי סיסטיק פיברוזיס לא רק בעת שימוש בנתונים מכל 32 הבארות, אלא גם כאשר שמונה בארות נבחרו באקראי לכל תרבית. התקבלו היסטוגרמות לארבע תרביות אילוסטרציה, המציגות את התפלגות הערכים למעגליות, את עוצמת החלק המרכזי של האורגנואיד ואת עוצמת האורגנואיד כולו.

בקרת איכות היא חיונית, שכן תמונות באיכות גבוהה נדרשות לחישוב מדויק של יחס העוצמה ומדד המעגליות. תרביות אורגנואידיות שהוקמו עבור ROMA יכולות לשמש גם כעזרים פיזיקליים כדי לבחון את ההשפעה של טיפול ב-CFTR. ניתן להפיק RNA, DNA וחלבון לצורך אפיון נוסף של גרסאות CFTR.