يتيح هذا البروتوكول ملاحظة العديد من الظواهر العصبية الفسيولوجية غير المفهومة جيدا ، مثل ترحيل كتلة الأعصاب بعد حقن التيار عالي التردد / عالي السعة ، مع منع التداخل من العمليات الأخرى في الجسم الحي. هذه التقنية تعطي نتائج قوية وقابلة للتكرار للغاية وهي أكثر عملية من الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي ، لأن المتغيرات المعقدة مثل عمق التخدير لا يجب التحكم فيها وبالتالي لا يمكن أن تؤثر على القياسات. بعد إجراء القتل الرحيم تحت التخدير ، ضع أنثى الفئران على طاولة التشريح ، وأمسك الكاحل بإحكام بين الإبهام والسبابة والإصبع الأوسط ، واقطع الوتر العقبي باستخدام مقص حاد مستقيم طوله 12 سم.
باستخدام ملقط ومقص ناعم ، قم بعمل شقوق دقيقة عبر طبقات العضلات بالقرب من منتصف الجزء الخلفي من الساق حتى يتعرض العصب الوركي. بمجرد أن يصبح العصب مرئيا ، قم بترطيب التجويف باستخدام المخزن المؤقت Krebs-Henseleit المعدل على الجليد ، أو MKHB ، لمنع العصب من الجفاف. باستخدام مرقئ الدم ، اسحب لوحات الجلد على كل جانب وحافظ على الشق مفتوحا لتشريح أدق.
بدءا من موقع شق الوتر العقبي ، باستخدام مقص دقيق ، قاطع العضلات على الجانب الإنسي من الساق لتحرير العصب. استمر في الحفاظ على مستويات الرطوبة في المنطقة باستخدام MKHB البارد المثلج. عندما يتعرض العصب أثناء التحرك لأعلى الساق ، قم بتشريح الأنسجة العضلية الفوقية.
حرر العصب الأقرب إلى العمود الفقري من الأنسجة الضامة حتى الوصول إلى الشق الشوكي ، وعند هذه النقطة يكون هناك خلل في العصب. لا تقم بتنظيف العصب بعد ، لأن السرعة ضرورية في هذه المرحلة. لتسهيل التشريح ، باستخدام الملقط ، اسحب بلطف نهاية العصب بالقرب من الكاحل.
ثم ، باستخدام مقص دقيق ، قم بتشديد العصب بالقرب من العمود الفقري. ضع العصب التشريحي في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر مملوء ب MKHB وضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد حتى بدء إجراء التنظيف. املأ طبق بتري المطلي في منتصف الطريق ب MKHB المؤكسج المبرد ، ثم ضع عصبا وركيا تشريحيا واحدا في الطبق وقم بتثبيت طرفي العصب على الطبق بحيث يكون العصب مستقيما دون مكامن الخلل أو الالتواء أو الالتواء.
باستخدام 6-0 خيوط حريرية أو خيط رفيع ، اربط عقدة مزدوجة حول كل طرف من أطراف العصب لمنع تسرب السيتوسول إلى المخزن المؤقت. ضع العقدة بجوار دبابيس الحشرات على الجانب بالقرب من مركز العصب لمنع التسرب من الأنسجة العصبية إلى المخزن المؤقت. تحت المجهر ، باستخدام مقص زنبركي بزاوية مليمترين وملقط ناعم ، قم بإزالة الدهون والأوعية الدموية والأنسجة العضلية من العصب.
تقليم أي فروع عصبية لن تستخدم في التحفيز والتسجيل. بعد كل خمس دقائق من التنظيف ، استبدل المخزن المؤقت ب MKHB طازج ومبرد ومؤكسج. بعد التنظيف ، ضع العصب مرة أخرى في أنبوب النقل المملوء بالمخزن المؤقت وأرح الأنبوب على الجليد.
قم بإعداد حمام أعصاب نظيف ثنائي الغرفة. باستخدام رؤوس ومقابض المختبر القياسية ، ضع حمام الأعصاب تحت مستوى الزجاجة سعة لترين الموضوعة على مقلب التسخين. قم بتوصيل تصريف الحمام بمدخل المضخة التمعجية.
قم بتوصيل مخرج المضخة التمعجية بأنبوب يؤدي إلى الزجاجة العازلة. قم بتوصيل مدخل الحمام بأنبوب باستخدام صمام تدفق قابل للتعديل ووضع الأنبوب داخل الزجاجة. استخدم صماما ثلاثي الاتجاهات مع حقنة متصلة بالمخرج الأوسط للمساعدة في تحضير الأنبوب كسفون للتدفق العازل بمساعدة الجاذبية.
قم بتعبئة السيفون عن طريق رسم المحقنة حتى يتدفق المخزن المؤقت إليها. قم بتكوين الصمام بحيث يكون معدل تدفق المخزن المؤقت إلى الحمام من خمسة إلى ستة ملليمترات في الدقيقة. يمكن زيادة معدل التدفق في البداية لملء الحمام.
بمجرد وصول مستوى المخزن المؤقت للحمام إلى البالوعة ، ضع الأعصاب في الحمام. باستخدام دبوس الحشرات ، قم بتأمين نهاية العصب في زاوية غرفة الحمام المملوءة بالمخزن المؤقت. باستخدام ملقط ناعم بزاوية 45 درجة وقرص العصب فقط في النهايات ، قم بربط العصب بعناية ليتم تحفيزه من خلال الفتحة الموجودة في القسم بين غرفتي الحمام.
باستخدام دبوس الحشرات ، قم بتأمين الطرف الآخر من العصب في غرفة الزيت في الحمام ، مما يضمن أن العصب مستقيم دون أن يتم تمديده وخاليا من مكامن الخلل والالتواءات. باستخدام شحوم السيليكون ، قم بعمل ختم لمنع تسرب المخزن المؤقت من الغرفة العازلة إلى غرفة الزيت املأ غرفة الزيت بالسيليكون أو الزيت المعدني. ضع خطافات قطب تسجيل كلوريد الفضة / الفضة في غرفة حمام الزيت وقم بتأمينها باستخدام رؤوس الرؤساء والقبضات.
ثم ، قم بلف جزء العصب في حمام الزيت فوق السنانير دون سحب العصب المشدود. اضبط أو أصلح ختم شحوم السيليكون إذا لوحظ أي تسرب بعد تحريك العصب. قم بتوصيل قطب كلوريد الفضة / الفضة المرجعي بأرض مكبر الصوت ووضع القطب الكهربائي في غرفة الحمام المملوءة بالمخزن المؤقت عن طريق تثبيته باستخدام مقبض مختبري.
بعد إعداد قطب الكفة العصبية النظيف للتحفيز ، ضع القطب الكهربائي في غرفة الحمام المملوءة بالمخزن المؤقت. باستخدام ملقط أو ملاقط دقيقة ذات أطراف حادة أو زاوية، افتح القطب الكهربائي في الحمام لتبلل الجزء الداخلي من الكفة. إذا بقيت الفقاعات، استخدم حقنة دقيقة لسحب المخزن المؤقت من الحمام وإجبار الفقاعات على الخروج من الكفة.
باستخدام الملقط ، افتح الكفة بلطف وحركها تحت العصب. أغلق الكفة حول العصب ، وتجنب أي خلل أو التواء في العصب. قم بتوصيل قطب التحفيز وقطب العودة الحالي بالمحفز.
إذا كنت تستخدم ورقة بلاتينية مربعة كقطب العودة الحالي ، فضع الورقة بعيدا عن العصب في الحمام. قم بتأمين كل من الأقطاب الكهربائية بالشريط. قم بتوصيل خرج إشارة TTL المحفز بالقناة الرابعة من منظار الذبذبات.
على شاشة منظار الذبذبات، اضغط على علامة التبويب قناة المشغل وحدد القناة الرابعة كقناة التشغيل. اضبط مستوى الزناد على فولت واحد باستخدام مقبض المستوى. على الذبذبات، اضبط دقة الوقت على مللي ثانية واحدة لكل قسمة ودقة الجهد على 10 مللي فولت لكل قسمة.
قم بتوسيط مرجع الزناد في الوقت المناسب واضبط مستوى المشغل على فولت واحد. بعد توصيل المحفز بالكمبيوتر ، قم بتشغيل المحفز عن طريق توصيل مصدر طاقة البطارية بمدخل الطاقة. ثم قم بتشغيل برنامج MATLAB على الكمبيوتر.
تنفيذ البرنامج النصي MATLAB المخصص. ثم افتح البرنامج النصي MATLAB المشار إليه. قم بتحرير البرنامج النصي واضبط سعة نبضة محفز المعلمات على ناقص 300 ميكروأمبير ، وعرض نبضة المحفز إلى 300 ميكروثانية ، وعدد نبضات المحفز إلى 10 ، ووقت المحفز بين النبضات إلى ثانية واحدة.
ابدأ تشغيل بروتوكول التحفيز بالنقر فوق تشغيل في البرنامج. كان لجهد العمل المركب ، أو CAP ، سعة من الذروة إلى الذروة تبلغ مللي فولت واحد عند القطب الكهربائي و 100 مللي فولت عند تضخيمها. يتم عرض استثارة الأعصاب النموذجية للأصفاد العصبية البلاتينية القياسية والأصفاد العصبية الموصلة المصنوعة خصيصا هنا.
يتم عرض CAP الذي تم الحصول عليه خارج الجسم الحي على مدار يوم من التجارب باستخدام كل من الأعصاب الوركية هنا. لوحظ الحد الأدنى من انخفاض سعة CAP مع العصب الوركي الأيمن. في المقابل، كانت سعة CAP للعصب الوركي الأيسر عند حوالي ثلاثة مللي فولت مشابهة لسعة العصب الوركي الأيمن في بداية التجربة بعد أكثر من ست ساعات من استخراج العصب.
التأكيد على الدقة والتكرار في تقنية التشريح والتنظيف والتنفيذ. انتبه إلى ما يحدث في الحمام. إذا فقدت الإشارة العصبية ، فقد يكون الأمر ببساطة أن الأقطاب الكهربائية ليست على اتصال جيد أو أن هناك محلول ملحي في قسم زيت الحمام ، وليس أن العصب قد مات.
قد يميل المستخدمون لأول مرة إلى التسرع ، خاصة خلال مرحلة التشريح. هذا من المرجح أن يؤدي إلى أخطاء وتلف العصب. الدقة والاتساق هما المفتاح هنا وسيؤديان إلى نتائج عالية الجودة.
وينبغي أيضا إيلاء اهتمام خاص للاتساق في إعداد المخزن المؤقت.
