이 프로토콜은 생체의 다른 과정으로부터의 간섭을 방지하면서 고주파 / 고 진폭 전류 주입 후 신경 블록 이월과 같이 잘 이해되지 않는 많은 신경 생리 학적 현상을 관찰 할 수있게합니다. 이 기술은 매우 반복 가능하고 강력한 결과를 산출하며 마취 깊이와 같은 복잡한 변수를 제어 할 필요가 없으므로 측정에 영향을 줄 수 없기 때문에 생체 내 전기 생리학보다 실용적입니다. 마취하에 안락사 절차를 마친 후 암컷 쥐를 해부 테이블에 놓고 엄지, 검지 손가락 및 가운데 손가락 사이에 발목을 단단히 잡고 12 센티미터 직선 무딘 가위를 사용하여 종아리 힘줄을 절단하십시오.
미세한 포셉과 가위를 사용하여 좌골 신경이 노출 될 때까지 다리 뒤쪽 중간 근처의 근육층을 조심스럽게 절개하십시오. 신경이 보이면 얼음처럼 차가운 변형 Krebs-Henseleit 버퍼 또는 MKHB를 사용하여 신경이 건조하지 않도록 공동에 수분을 공급하십시오. 지혈제를 사용하여 양쪽의 피부 플랩을 당기고 절개를 열어 더 미세한 해부를 유지하십시오.
종아리 힘줄 절개 위치에서 시작하여 미세한 가위를 사용하여 다리의 내측 쪽의 근육을 방해하여 신경을 풀어줍니다. 얼음처럼 차가운 MKHB가있는 지역의 수분 수준을 계속 유지하십시오. 다리를 위로 움직이는 동안 신경이 노출되면 위에 놓인 근육 조직을 해부하십시오.
척추 구개열에 도달 할 때까지 결합 조직에서 척추에 더 가까운 신경을 풀어 주면 신경에 꼬임이 생깁니다. 이 단계에서 속도가 필수적이므로 아직 신경을 청소하지 마십시오. 해부를 쉽게하려면 포셉을 사용하여 발목 근처의 신경 끝을 부드럽게 당깁니다.
그런 다음 미세한 가위를 사용하여 척추에 가까운 신경을 심하게합니다. 해부 된 신경을 MKHB로 채워진 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 넣고 세척 절차가 시작될 때까지 튜브를 얼음 위에 다시 놓습니다. 코팅 된 페트리 접시를 차가운 산소화 된 MKHB로 반쯤 채운 다음 해부 된 좌골 신경을 접시에 넣고 신경의 양쪽 끝을 접시에 고정시켜 신경이 꼬임, 비틀림 또는 비틀림없이 똑바로 보이도록하십시오.
6-0 실크 봉합사 또는 미세 실을 사용하여 신경의 양쪽 끝 주위에 이중 매듭을 묶어 시토졸이 버퍼로 누출되는 것을 방지합니다. 매듭을 곤충 핀 바로 옆에 놓아 신경 조직에서 버퍼로 누출되는 것을 방지하기 위해 신경 중심에 더 가깝게 놓습니다. 현미경으로 두 밀리미터 각도의 스프링 가위와 미세 포셉을 사용하여 신경에서 지방, 혈관 및 근육 조직을 제거합니다.
자극 및 기록에 사용되지 않을 신경 가지를 가지치십시오. 다섯 분마다 청소를 마친 후 버퍼를 신선하고 차갑고 산소가 함유 된 MKHB로 교체하십시오. 청소 후, 신경을 버퍼로 채워진 수송 튜브에 다시 넣고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
깨끗하고 이중 챔버 신경 목욕을 준비하십시오. 표준 실험실 보스 헤드와 그리퍼를 사용하여 신경 욕조를 가열 교반기에 놓인 두 리터 병 수준 아래에 놓습니다. 욕조의 배수구를 연동 펌프 입구에 연결하십시오.
연동 펌프의 출구를 버퍼 병으로 돌아가는 튜브에 연결하십시오. 욕조 입구를 조절 가능한 흐름 밸브가있는 튜브에 연결하고 튜브를 병 안에 넣으십시오. 중간 출구에 연결된 주사기가있는 삼방 밸브를 사용하여 중력 보조 버퍼 유입을위한 사이펀으로 튜브를 프라이밍하는 데 도움을줍니다.
버퍼가 그 안으로 흐를 때까지 주사기를 그려서 사이펀을 프라임합니다. 욕조로의 버퍼 유량이 분당 다섯 ~ 여섯 밀리미터가 되도록 밸브를 구성합니다. 유속은 욕조를 채우기 위해 초기에 증가 될 수 있습니다.
목욕 완충 수준이 배수구에 도달하면 신경을 욕조에 넣으십시오. 곤충 핀을 사용하여 버퍼가 채워진 욕조 챔버의 모서리에 신경의 끝을 고정하십시오. 45도 각도의 미세 포셉을 사용하여 끝에서만 신경을 꼬집고 두 개의 욕조 챔버 사이의 파티션에있는 구멍을 통해 자극받을 신경을 조심스럽게 실을 꿰매십시오.
곤충 핀을 사용하여 욕조의 오일 챔버에 신경의 다른 쪽 끝을 고정하여 신경이 늘어나지 않고 똑바로 펴지고 꼬임과 비틀림이 없는지 확인하십시오. 실리콘 그리스를 사용하여 버퍼 챔버에서 오일 챔버로 버퍼 누출을 방지하기 위해 씰을 만듭니다 오일 챔버를 실리콘 또는 미네랄 오일로 채 웁니다. 은/은/염화은 기록 전극 후크를 오일 배스 챔버에 놓고 보스 헤드와 그리퍼를 사용하여 고정합니다.
그런 다음 기름 욕조에서 신경 부분을 신경 덩어리를 당기지 않고 후크 위로 드레이프하십시오. 신경을 이동시킨 후 누출이 관찰되는 경우 실리콘 그리스 씰을 조정하거나 수리하십시오. 기준 은/염화은 전극을 증폭기 접지에 연결하고 실험실 그리퍼를 사용하여 전극을 고정하여 버퍼가 채워진 욕조 챔버에 놓습니다.
자극을 위한 깨끗한 신경 커프 전극을 준비한 후, 전극을 버퍼가 채워진 욕조 챔버에 놓는다. 무딘 팁이나 각진 팁이있는 포셉 또는 미세한 핀셋을 사용하여 욕조에서 전극을 열어 커프 내부를 적시십시오. 거품이 남아 있으면 미세한 주사기를 사용하여 욕조에서 버퍼를 뽑아 커프에서 거품을 강제로 꺼냅니다.
트위저를 사용하여 커프를 부드럽게 열고 신경 아래로 밀어 넣습니다. 신경 주위의 커프를 닫고 신경의 꼬임이나 비틀림을 피하십시오. 자극 전극과 전류 복귀 전극을 자극기에 연결한다.
사각형 백금 시트를 전류 복귀 전극으로 사용하는 경우, 시트를 욕조의 신경에서 멀리 떨어 뜨립니다. 두 전극의 리드를 테이프로 고정하십시오. 출력되는 자극기 TTL 신호를 오실로스코프의 채널 네 개에 연결합니다.
오실로스코프 화면에서 트리거 채널 탭을 누르고 채널 네 개를 트리거 채널로 지정합니다. 레벨 노브를 사용하여 트리거 레벨을 하나의 볼트로 설정합니다. 오실로스코프에서 시간 분해능을 분할당 1밀리초로 설정하고 전압 분해능을 분할당 10밀리볼트로 설정합니다.
트리거 참조를 제 시간에 중앙에 맞추고 트리거 레벨을 하나의 볼트로 설정합니다. 자극기를 컴퓨터에 연결한 후 배터리 전원 공급 장치를 전원 입력에 연결하여 자극기를 켭니다. 그런 다음 컴퓨터에서 MATLAB 소프트웨어를 시작합니다.
사용자 지정 MATLAB 스크립트를 실행합니다. 그런 다음 표시된 MATLAB 스크립트를 엽니다. 스크립트를 편집하고 파라미터 자극기 펄스 진폭을 영하 300마이크로암페어, 자극기 펄스 폭을 300마이크로초, 자극기 펄스 수를 10초, 펄스 간 자극기 시간을 1초로 설정합니다.
소프트웨어에서 실행을 클릭하여 자극 프로토콜을 시작하십시오. 복합 작용 전위 또는 CAP는 전극에서 1 밀리볼트의 피크 대 피크 진폭과 증폭 될 때 100 밀리볼트를 가졌습니다. 표준 백금 신경 커프스와 맞춤형 전도성 엘라스토머 신경 커프에 대한 전형적인 신경 흥분성이 여기에 나와 있습니다.
두 좌골 신경을 모두 사용한 실험의 날에 걸쳐 생체외에서 수득된 CAP가 여기에 도시되어 있다. 최소 CAP 진폭 감소는 우측 좌골 신경에서 관찰되었다. 대조적으로, 대략 세 밀리볼트에서의 좌측 좌골 신경 CAP 진폭은 신경 추출 후 여섯 시간 이상 실험 시작시 우측 좌골 신경의 진폭과 유사하였다.
해부, 청소 및 구현 기술에서 정밀도와 반복성을 강조하십시오. 목욕탕에서 일어나는 일에주의를 기울이십시오. 신경 신호가 손실되면 단순히 전극이 잘 접촉하지 않거나 욕조 오일 파티션에 식염수가 있고 신경이 죽지 않을 수 있습니다.
처음 사용자는 특히 해부 단계에서 서두르고 싶을 수 있습니다. 이것은 실수로 이어지고 신경을 손상시킬 수 있습니다. 정밀도와 일관성은 여기에서 핵심이며 더 높은 품질의 결과로 이어질 것입니다.
버퍼 준비의 일관성에도 특별한주의를 기울여야합니다.
