Bu protokol, yüksek frekanslı / yüksek genlikli akım enjeksiyonundan sonra sinir bloğu taşınması gibi iyi anlaşılmamış birçok nörofizyolojik fenomenin gözlemlenmesini sağlarken, canlı bir vücuttaki diğer süreçlerden kaynaklanan parazitleri önler. Bu teknik oldukça tekrarlanabilir, sağlam sonuçlar verir ve in vivo elektrofizyolojiden daha pratiktir, çünkü anestezi derinliği gibi karmaşık değişkenlerin kontrol edilmesi gerekmez ve bu nedenle ölçümleri etkileyemez. Anestezi altında bir ötenazi prosedüründen sonra, diseksiyon masasına dişi bir sıçan yerleştirin, ayak bileğini başparmak, işaret parmağı ve orta parmak arasında sıkıca tutun ve 12 santimetrelik düz künt makas kullanarak kalkaneal tendonu kesin.
İnce forseps ve makas kullanarak, siyatik sinir açığa çıkana kadar bacağın arkasının ortasına yakın kas katmanlarından dikkatli kesikler yapın. Sinir görünür olduğunda, sinirin kurumasını önlemek için buz gibi soğuk modifiye Krebs-Henseleit tamponu veya MKHB kullanarak boşluğu nemlendirin. Hemostatları kullanarak, her iki taraftaki cilt kapaklarını çekin ve daha ince diseksiyon için insizyonu açık tutun.
Kalkaneal tendon insizyon lokalizasyonundan başlayarak, ince makas kullanarak, siniri serbest bırakmak için bacağın medial tarafındaki kası kesin. Buz gibi soğuk MKHB ile bölgedeki nem seviyelerini korumaya devam edin. Bacak yukarı doğru hareket ederken sinir açığa çıktığından, üstteki kas dokusunu disseke edin.
Omurgaya yakın olan siniri, omurga yarığına ulaşana kadar bağ dokularından serbest bırakın, bu noktada sinirde bir bükülme vardır. Siniri henüz temizlemeyin, çünkü bu aşamada hız esastır. Diseksiyonu kolaylaştırmak için, forseps kullanarak, sinirin ucunu ayak bileğinin yanına yavaşça çekin.
Daha sonra, ince makas kullanarak, omurgaya yakın siniri şiddetlendirin. Disseke edilmiş siniri MKHB ile doldurulmuş 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve temizleme prosedürünün başlamasına kadar tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin. Kaplanmış Petri kabını yarıya kadar soğutulmuş oksijenli MKHB ile doldurun, ardından bir disseke siyatik siniri tabağa yerleştirin ve sinirin her iki ucunu da sinirin bükülme, burulma veya bükülme olmadan düz olacak şekilde tabağa sabitleyin.
6-0 ipek dikiş veya ince iplik kullanarak, tampona sitosol sızıntısını önlemek için sinirin her iki ucuna çift düğüm bağlayın. Düğümleri, sinir dokusundan tampona sızmasını önlemek için sinirin merkezine daha yakın olan taraftaki böcek pimlerinin hemen yanına yerleştirin. Mikroskop altında, iki milimetrelik açılı yay makası ve ince forseps kullanarak, sinirden yağ, kan damarları ve kas dokusunu çıkarın.
Stimülasyon ve kayıtta kullanılmayacak sinir dallarını budayın. Her beş dakikalık temizlikten sonra, tamponu taze, soğutulmuş, oksijenli MKHB ile değiştirin. Temizledikten sonra, siniri tamponla doldurulmuş taşıma tüpüne geri yerleştirin ve tüpü buz üzerinde dinlendirin.
Temiz, çift odacıklı bir sinir banyosu hazırlayın. Standart laboratuvar patron kafalarını ve tutucularını kullanarak, sinir banyosunu ısıtma karıştırıcısına yerleştirilen iki litrelik şişenin seviyesinin altına yerleştirin. Banyonun tahliyesini peristaltik pompa girişine bağlayın.
Peristaltik pompanın çıkışını tampon şişesine geri giden bir tüpe bağlayın. Banyo girişini ayarlanabilir bir akış valfi ile bir tüpe bağlayın ve tüpü şişenin içine yerleştirin. Yerçekimi destekli tampon girişi için tüpün sifon olarak astarlanmasına yardımcı olması için orta çıkışa bağlı bir şırıngaya sahip üç bir valf kullanın.
Şırıngayı tampon içine akana kadar çekerek sifonu astarlayın. Valfi, banyoya tampon akış hızı dakikada beş ila altı milimetre olacak şekilde yapılandırın. Akış hızı başlangıçta banyoyu doldurmak için arttırılabilir.
Banyo tamponu seviyesi drenaja ulaştığında, sinirleri banyoya yerleştirin. Bir böcek pimi kullanarak, sinirin ucunu tampon dolu banyo odasının köşesine sabitleyin. 45 derecelik açılı ince forseps kullanarak ve siniri sadece uçlarından sıkıştırarak, iki banyo odası arasındaki bölmedeki delikten uyarılmak üzere siniri dikkatlice geçirin.
Bir böcek pimi kullanarak, sinirin diğer ucunu banyonun yağ odasına sabitleyin, sinirin gerilmeden düz olmasını ve bükülme ve bükülmelerden arındırılmış olmasını sağlayın. Silikon gres kullanarak, tampon odasından yağ odasına tampon sızıntısını önlemek için bir conta yapın Yağ odasını silikon veya mineral yağ ile doldurun. Gümüş/gümüş klorür kayıt elektrot kancalarını yağ banyosu odasına yerleştirin ve patron kafaları ve tutucular kullanarak sabitleyin.
Daha sonra, sinirin yağ banyosundaki kısmını, siniri gerginleştirmeden kancaların üzerine örtün. Siniri hareket ettirdikten sonra herhangi bir sızıntı gözlenirse silikon gres contasını ayarlayın veya onarın. Referans gümüş/gümüş klorür elektrodunu amplifikatör zeminine bağlayın ve elektrodu bir laboratuvar tutucusu kullanarak sabitleyerek tampon dolu banyo odasına yerleştirin.
Stimülasyon için temiz bir sinir manşet elektrodu hazırladıktan sonra, elektrodu tampon dolu banyo odasına yerleştirin. Forseps veya künt veya açılı uçlu ince cımbız kullanarak, manşetin içini ıslatmak için banyodaki elektrodu açın. Kabarcıklar kalırsa, banyodan tampon çekmek için ince bir şırınga kullanın ve kabarcıkları manşetten dışarı çıkmaya zorlayın.
Bir cımbız kullanarak, manşeti yavaşça açın ve sinirin altına kaydırın. Sinirin etrafındaki manşeti kapatın, sinirin bükülmesini veya bükülmesini önleyin. Stimülasyon elektrodunu ve akım dönüş elektrodunu stimülatöre bağlayın.
Akım dönüş elektrodu olarak kare platin bir tabaka kullanıyorsanız, tabakayı banyodaki sinirden uzağa yerleştirin. Her iki elektrot kablosunu da bantla sabitleyin. Stimülatör TTL sinyal çıkışını osiloskopun dördüncü kanalına bağlayın.
Osiloskop ekranında, Tetikleyici kanal sekmesine basın ve tetikleyici kanal olarak dördüncü kanalı belirtin. Seviye düğmesini kullanarak tetik seviyesini bir volta ayarlayın. Osiloskopta, zaman çözünürlüğünü bölüm başına bir milisaniyeye ve voltaj çözünürlüğünü bölüm başına 10 milivolta ayarlayın.
Tetik referansını zamanında ortalayın ve tetik seviyesini bir volta ayarlayın. Stimülatörünü bilgisayara bağladıktan sonra, pil güç kaynağını güç girişine bağlayarak uyarıcıyı açın. Ardından, bilgisayarda MATLAB yazılımını başlatın.
Özel MATLAB komut dosyasını yürütün. Ardından, belirtilen MATLAB komut dosyasını açın. Komut dosyasını düzenleyin ve uyarıcı darbe genliği parametrelerini eksi 300 mikroamper, uyarıcı darbe genişliği 300 mikrosaniye, uyarıcı darbe sayısı 10 ve darbeler arasındaki uyarıcı süresi bir saniye olarak ayarlayın.
Yazılımda Çalıştır'a tıklayarak stimülasyon protokolünü başlatın. Bileşik aksiyon potansiyeli veya CAP, elektrotta bir milivolt ve yükseltildiğinde 100 milivoltluk bir tepeden tepeye genliğe sahipti. Standart platin sinir manşetleri ve ısmarlama iletken elastomer sinir manşetleri için tipik sinir uyarılabilirliği burada gösterilmiştir.
Her iki siyatik siniri kullanarak bir günlük deney boyunca ex vivo elde edilen CAP burada gösterilmiştir. Sağ siyatik sinir ile minimal CAP genlik azalması gözlendi. Buna karşılık, yaklaşık üç milivolttaki sol siyatik sinir CAP genliği, sinir ekstraksiyonundan altı saatten fazla bir süre sonra deneyin başlangıcındaki sağ siyatik sinirinkine benzerdi.
Diseksiyon, temizlik ve uygulama tekniğinde hassasiyeti ve tekrarlanabilirliği vurgulayın. Banyoda neler olup bittiğine dikkat edin. Sinir sinyali kaybolursa, elektrotların iyi temas halinde olmaması veya banyo yağı bölümünde salin bulunması ve sinirin ölmesi olmayabilir.
İlk kez kullananlar, özellikle diseksiyon aşamasında, acele etmeye cazip gelebilir. Bu muhtemelen hatalara yol açacak ve sinire zarar verecektir. Hassasiyet ve tutarlılık burada anahtardır ve daha kaliteli sonuçlara yol açacaktır.
Tampon hazırlamada tutarlılığa da özel dikkat gösterilmelidir.
