Este protocolo permite la observación de muchos fenómenos neurofisiológicos que no se comprenden bien, como el arrastre de bloqueo nervioso después de la inyección de corriente de alta frecuencia / alta amplitud, al tiempo que evita la interferencia de otros procesos en un cuerpo vivo. Esta técnica produce resultados altamente repetibles y robustos y es más práctica que la electrofisiología in vivo, porque las variables complejas como la profundidad de la anestesia no tienen que ser controladas y, por lo tanto, no pueden influir en las mediciones. Después de un procedimiento de eutanasia bajo anestesia, coloque una rata hembra en la mesa de disección, sostenga el tobillo firmemente entre el pulgar, el dedo índice y el dedo medio, y corte el tendón calcánea con tijeras romas rectas de 12 centímetros.
Usando fórceps finos y tijeras, haga incisiones cuidadosas a través de las capas musculares cerca de la mitad de la parte posterior de la pierna hasta que el nervio ciático esté expuesto. Una vez que el nervio sea visible, hidrate la cavidad usando un tampón Krebs-Henseleit modificado con hielo, o MKHB, para evitar que el nervio se seque. Usando hemostáticos, tire de los colgajos de piel de cada lado y mantenga la incisión abierta para una disección más fina.
A partir de la ubicación de la incisión del tendón calcáneo, usando tijeras finas, interrumpe el músculo en el lado medial de la pierna para liberar el nervio. Continúe manteniendo los niveles de humedad en el área con MKHB helado. A medida que el nervio está expuesto mientras se mueve hacia arriba de la pierna, diseccione el tejido muscular suprayacente.
Libere el nervio más cercano a la columna vertebral de los tejidos conectivos hasta llegar a la hendidura espinal, momento en el que hay una torcedura en el nervio. No limpie el nervio todavía, ya que la velocidad es esencial en esta etapa. Para facilitar la disección, use fórceps, tire suavemente del extremo del nervio cerca del tobillo.
Luego, usando tijeras finas, severe el nervio cerca de la columna vertebral. Coloque el nervio diseccionado en un tubo centrífugo de 15 mililitros lleno de MKHB y vuelva a colocar el tubo sobre el hielo hasta el inicio del procedimiento de limpieza. Llene la placa de Petri recubierta hasta la mitad con MKHB oxigenado refrigerado, luego coloque un nervio ciático diseccionado en el plato y fije ambos extremos del nervio al plato de modo que el nervio esté recto sin torceduras, torsión o giros.
Usando suturas de seda 6-0 o hilo fino, ate un nudo doble alrededor de cada extremo del nervio para evitar la fuga de citosol en el tampón. Coloque los nudos justo al lado de los alfileres de insectos en el lado más cercano al centro del nervio para evitar la fuga de tejido nervioso en el amortiguador. Bajo un microscopio, usando tijeras de resorte en ángulo de dos milímetros y fórceps finos, elimine la grasa, los vasos sanguíneos y el tejido muscular del nervio.
Pode cualquier rama nerviosa que no se utilizará en la estimulación y el registro. Después de cada cinco minutos de limpieza, reemplace el tampón con MKHB fresco, refrigerado y oxigenado. Después de la limpieza, coloque el nervio de nuevo en el tubo de transporte lleno de tampón y apoye el tubo sobre hielo.
Prepare un baño nervioso limpio de doble cámara. Usando cabezales y pinzas estándar de jefe de laboratorio, coloque el baño nervioso por debajo del nivel de la botella de dos litros colocada en el agitador de calefacción. Conecte el desagüe del baño a la entrada de la bomba peristáltica.
Conecte la salida de la bomba peristáltica a un tubo que conduce de vuelta a la botella tampón. Conecte la entrada del baño a un tubo con una válvula de flujo ajustable y coloque el tubo dentro de la botella. Use una válvula de tres vías con una jeringa conectada a la salida central para ayudar a cebar el tubo como un sifón para la entrada de búfer asistida por gravedad.
Prepare el sifón extrayendo la jeringa hasta que el tampón fluya hacia él. Configure la válvula de tal manera que el caudal de amortiguación en el baño sea de cinco a seis milímetros por minuto. El caudal se puede aumentar inicialmente para llenar el baño.
Una vez que el nivel del amortiguador del baño haya alcanzado el drenaje, coloque los nervios en el baño. Usando un alfiler de insecto, asegure el extremo del nervio en la esquina de la cámara de baño llena de tampón. Usando fórceps finos en ángulo de 45 grados y pellizcando el nervio solo en los extremos, enhebra cuidadosamente el nervio para ser estimulado a través del orificio en la partición entre las dos cámaras de baño.
Usando un alfiler de insecto, asegure el otro extremo del nervio en la cámara de aceite del baño, asegurándose de que el nervio esté recto sin estirarse y esté libre de torceduras y giros. Usando grasa de silicona, haga un sello para evitar la fuga de amortiguación de la cámara de amortiguación a la cámara de aceite Llene la cámara de aceite con silicona o aceite mineral. Coloque los ganchos de electrodos de grabación de cloruro de plata / plata en la cámara del baño de aceite y asegúrelos con cabezales de jefe y pinzas.
Luego, cubra la porción del nervio en el baño de aceite sobre los ganchos sin tirar del nervio tenso. Ajuste o repare el sello de grasa de silicona si se observa alguna fuga después de mover el nervio. Conecte el electrodo de plata/cloruro de plata de referencia a la toma a tierra del amplificador y colóquelo en la cámara de baño llena de tampón asegurándolo con una pinza de laboratorio.
Después de preparar un electrodo de manguito nervioso limpio para la estimulación, coloque el electrodo en la cámara de baño llena de tampón. Usando pinzas o pinzas finas con puntas romas o en ángulo, abra el electrodo en el baño para mojar el interior del manguito. Si quedan burbujas, use una jeringa fina para extraer el tampón del baño y forzar las burbujas a salir del manguito.
Usando una pinza, abra suavemente el manguito y deslícelo debajo del nervio. Cierre el manguito alrededor del nervio, evitando cualquier torcedura o torsión del nervio. Conecte el electrodo de estimulación y el electrodo de retorno de corriente al estimulador.
Si usa una lámina de platino cuadrada como electrodo de retorno de corriente, coloque la hoja lejos del nervio en el baño. Asegure ambos cables de los electrodos con cinta adhesiva. Conecte la salida de señal TTL del estimulador al canal cuatro del osciloscopio.
En la pantalla del osciloscopio, presione la pestaña Canal de activación y especifique el canal cuatro como canal de activación. Ajuste el nivel del gatillo a un voltio usando la perilla de nivel. En el osciloscopio, establezca la resolución de tiempo en un milisegundo por división y la resolución de voltaje en 10 milivoltios por división.
Centra la referencia del disparador en el tiempo y establece el nivel del disparador en un voltio. Después de conectar el estimulador a la computadora, encienda el estimulador conectando la fuente de alimentación de la batería a la entrada de energía. A continuación, inicie el software MATLAB en el equipo.
Ejecute el script de MATLAB personalizado. A continuación, abra el script de MATLAB indicado. Edite el script y establezca los parámetros amplitud del pulso del estimulador en menos 300 microamperios, ancho del pulso del estimulador en 300 microsegundos, número de pulsos del estimulador en 10 y tiempo del estimulador entre pulsos a un segundo.
Inicie el protocolo de estimulación haciendo clic en Ejecutar en el software. El potencial de acción compuesto, o CAP, tenía una amplitud de pico a pico de un milivoltio en el electrodo y 100 milivoltios cuando se amplificaba. La excitabilidad nerviosa típica para los manguitos nerviosos de platino estándar y los manguitos nerviosos de elastómero conductor hechos a medida se muestran aquí.
El CAP obtenido ex vivo durante un día de experimentos utilizando ambos nervios ciáticos se muestra aquí. Se observó una reducción mínima de la amplitud de la CAP con el nervio ciático derecho. En contraste, la amplitud de la CAP del nervio ciático izquierdo a aproximadamente tres milivoltios fue similar a la del nervio ciático derecho al comienzo del experimento más de seis horas después de la extracción del nervio.
Enfatizar la precisión y la repetibilidad en la disección, limpieza y técnica de implementación. Preste atención a lo que está sucediendo en el baño. Si se pierde la señal nerviosa, puede ser simplemente que los electrodos no están en buen contacto o que hay solución salina en la partición de aceite del baño, y no que el nervio esté muerto.
Los usuarios primerizos pueden verse tentados a apresurarse, especialmente durante la fase de disección. Esto probablemente conducirá a errores y dañará el nervio. La precisión y la consistencia son clave aquí y conducirán a resultados de mayor calidad.
También debe prestarse especial atención a la coherencia en la preparación del tampón.
