大鼠坐骨神经用于 离体 神经生理学的制备

该协议可以观察许多不太清楚的神经生理现象，例如高频/高振幅电流注射后的神经阻滞残留，同时防止来自活体中其他过程的干扰。该技术产生高度可重复的可靠结果，并且比体内电生理学更实用，因为麻醉深度等复杂变量不必控制，因此不会影响测量。麻醉下进行安乐死手术后，将雌性大鼠放在解剖台上，将脚踝牢牢地握在拇指，食指和中指之间，并用12厘米直的钝剪刀切断跟骨肌腱。

使用细镊子和剪刀，通过靠近腿部后部中间的肌肉层仔细切开，直到坐骨神经暴露出来。一旦神经可见，使用冰冷的改良克雷布斯 - 亨塞莱特缓冲液或MKHB滋润腔，以防止神经干燥。使用止血剂，拉动每侧的皮肤瓣，并保持切口打开以进行更精细的解剖。

从跟骨肌腱切口位置开始，用细剪刀打断腿内侧肌肉以释放神经。继续用冰冷的MKHB保持该地区的湿度水平。当神经在沿着腿向上移动时暴露时，解剖上覆的肌肉组织。

将靠近脊柱的神经从结缔组织中释放出来，直到到达脊柱裂，此时神经中存在扭结。不要清洁神经，因为在这个阶段，速度是必不可少的。为了使解剖更容易，使用镊子，轻轻地拉动脚踝附近的神经末端。

然后，用细剪刀，使靠近脊柱的神经严重。将解剖的神经放入装有MKHB的15毫升离心管中，然后将管放回冰上，直到清洁程序开始。用冷却的含氧MKHB填充涂覆的培养皿的一半，然后将一个解剖的坐骨神经放入培养皿中，并将神经的两端固定到培养皿上，使神经是直的，没有扭结，扭转或扭曲。

使用6-0丝缝合线或细线，在神经两端打一个双结，以防止细胞质基质泄漏到缓冲液中。将结放在靠近神经中心的一侧的昆虫针旁边，以防止从神经组织泄漏到缓冲区中。在显微镜下，使用两毫米角弹簧剪刀和细镊子，从神经中去除脂肪，血管和肌肉组织。

修剪任何不会用于刺激和记录的神经分支。每五分钟清洁一次后，用新鲜、冷却、含氧的MKHB替换缓冲液。清洁后，将神经放回充满缓冲液的运输管中，并将管子放在冰上。

准备一个干净的双室神经浴。使用标准的实验室凸台头和夹具，将神经浴置于放置在加热搅拌器上的两升瓶的水平下方。将浴槽的排水口连接到蠕动泵入口。

将蠕动泵的出口连接到通回缓冲瓶的管子上。使用可调节的流量阀将浴缸入口连接到管子上，然后将管子放在瓶子内。使用三通阀，注射器连接到中间出口，以帮助将管子作为重力辅助缓冲器流入的虹吸管。

通过拉动注射器来启动虹吸管，直到缓冲区流入其中。配置阀门，使进入浴槽的缓冲流速为每分钟五到六毫米。最初可以增加流速以填充浴槽。

一旦浴液缓冲液水平达到排水管，将神经放入浴槽中。使用昆虫针，将神经末端固定在充满缓冲液的浴室的角落。使用45度角的细镊子并仅在末端捏住神经，小心地通过两个浴室之间隔板上的孔来穿刺要刺激的神经。

使用昆虫针，将神经的另一端固定在浴池的油室中，确保神经是直的而不会被拉伸，并且没有扭结和扭曲。使用硅脂，做一个密封，以防止缓冲液从缓冲室泄漏到油室用硅油或矿物油填充油室。将银/氯化银记录电极钩放在油浴室中，并使用凸台头和夹具固定它们。

然后，将油浴中的神经部分覆盖在钩子上，而不会拉紧神经。调整或修复硅脂密封，如果在移动神经后观察到任何泄漏。将参比银/氯化银电极连接到放大器接地，并使用实验室夹具固定电极，将其置于充满缓冲液的浴槽室中。

准备用于刺激的干净神经袖带电极后，将电极置于充满缓冲液的浴室中。使用带有钝头或倾斜尖端的镊子或细镊子，在浴缸中打开电极以弄湿袖口内部。如果仍有气泡，请使用精细的注射器从浴中抽出缓冲液，并将气泡从袖口中取出。

使用镊子，轻轻打开袖口并将其滑到神经下方。关闭神经周围的袖带，避免神经的任何扭结或扭曲。将刺激电极和电流回流电极连接到刺激器。

如果使用方形铂片作为电流回流电极，请将片材放置在远离浴槽中神经的位置。用胶带固定电极的引线。将激励器TTL信号输出连接到示波器的通道4。

在示波器屏幕上，按“触发通道”选项卡，并将通道 4 指定为触发通道。使用电平旋钮将触发电平设置为 1 伏。在示波器上，将时间分辨率设置为每分 1 毫秒，将电压分辨率设置为每分 10 毫伏。

及时将触发参考值居中，并将触发电平设置为 1 伏。将刺激器连接到计算机后，通过将电池电源连接到电源输入来打开刺激器。然后，在计算机上启动 MATLAB 软件。

执行自定义的 MATLAB 脚本。然后，打开指示的 MATLAB 脚本。编辑脚本并将参数刺激器脉冲幅度设置为负300微安，刺激器脉冲宽度设置为300微秒，刺激器脉冲数设置为10，刺激器脉冲间隔时间设置为1秒。

通过单击软件中的“运行”来启动刺激方案。复合动作电位或CAP在电极处的峰峰值幅度为1毫伏，放大时为100毫伏。标准铂神经袖带和定制导电弹性体神经袖带的典型神经兴奋性如下所示。

这里显示了使用两种坐骨神经进行一天实验后离体获得的CAP。用右坐骨神经观察到最小的CAP振幅减小。相比之下，左坐骨神经CAP振幅在大约三毫伏时与实验开始时右坐骨神经的振幅相似，神经拔除后六个多小时。

强调解剖、清洁和实施技术的精度和可重复性。注意浴缸里发生的事情。如果神经信号丢失，可能只是电极没有很好地接触或浴油分区中有盐水，而不是神经死亡。

第一次使用的用户可能会忍不住匆匆忙忙，尤其是在解剖阶段。这可能会导致错误并损害神经。精度和一致性是这里的关键，并将带来更高质量的结果。

还应特别注意缓冲液制备的一致性。