هذا البروتوكول هو وسيلة مباشرة ومجدية للطلاب الجامعيين لإجراء أبحاث حقيقية يمكن أن تؤدي إلى نتائج قابلة للنشر. الميزة الرئيسية هي أنه يمكن للطلاب إجراء بحث أصلي حول الأسئلة التي يقررونها بأنفسهم. للبدء ، قم بعمل موزع محلول عن طريق ثني ماصة باستور الزجاجية سعة تسعة ملليلتر بعناية في لهب موقد بنسن وإغلاق فتحة الماصة.
ثم يقوم الإيثانول بتعقيم الموزع قبل كل انتشار على لوحة Petri. باستخدام micropipetter ، ضع 100 ميكرولتر من التخفيف على وسط الأجار وانتشر بلطف عبر السطح باستخدام الموزع المعقم. ثم ضع أطباق بتري المغطاة جانبا واترك المحلول ينقع في السطح حتى يجف.
بالنسبة لفترات التعرض التي تزيد عن 12 ساعة ، أضف 50 ميكرولترا من ثقافة الإشريكية القولونية بين عشية وضحاها إلى الألواح قبل إضافة الديدان الخيطية ، بينما بالنسبة للتجارب الحادة لمدة 12 ساعة أو أقل ، ليست هناك حاجة إلى وجود E.coli على اللوحات. باستخدام ماصة دقيقة ، ضع ملليلتر واحد من الماء المعقم على صفيحة الديدان الخيطية. بعد ذلك ، قم بتحريك الماء لرفع الديدان الخيطية ، ثم قم بإزالة السائل مع الديدان الخيطية إلى أنبوب microfuge سعة 1.5 ملليلتر.
بعد 10 دقائق ، عندما تستقر الديدان الخيطية بواسطة الجاذبية ، قم بإزالة ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من الماء بعناية وتخلص منها. ثم أعد تعليق الديدان الخيطية ، وباستخدام طرف ماصة أصفر مقطوع ، قم بإزالة 50 إلى 100 ميكرولتر من الديدان العالقة إلى كل لوحة معالجة ، مما يضمن أن كل صفيحة تحتوي على 10 ديدان بالغة على الأقل. قم بإعداد شريحتين عن طريق وضع قطعة من شريط الملصق على جانب واحد فقط من الشريحة لتشكيل وسادة بسماكة موحدة، ثم ضع شريحة نظيفة غير مستخدمة بينهما على سطح الطاولة.
ضع قطرة 10 ميكرولتر من الأغاروز المذاب في وسط الشريحة باستخدام ماصة صغيرة. ثم قم بتسطيح القطرة عن طريق وضع شريحة نظيفة أخرى في الأعلى عموديا على الشريحة مع السقوط والضغط بحيث تشكل قطرة الأغاروز سمك شريط وضع العلامات. بعد ذلك ، قم بتطبيق ضغط ثابت لفصل الشريحتين.
ثم ضع هذه الشريحة مع جانب الأجار لأعلى على سطح الطاولة واتركها لتجف لمدة دقيقة إلى دقيقتين قبل الاستخدام. لإضافة الديدان الخيطية من الشريحة المحضرة مع وسادة agarose ، أضف قطرة من الماء سعة خمسة ميكرولتر تحتوي على أزيد الصوديوم المولي إلى وسادة الأجار ، والتي ستقوم بتخدير الديدان وتعبئتها. ثم نقل في 10 الديدان الخيطية لكل شريحة العلاج إلى قطرة باستخدام اختيار دودة ، والتي ينبغي تعقيمها قبل وبعد نقل الديدان الخيطية.
بعد ذلك ، أضف زلة غطاء باستخدام ملقط عن طريق وضعها بزاوية وخفضها ببطء. بعد ذلك ، ضع الحامل الرطب المحضر على مجهر الفلورسنت لمراقبة الديدان أولا تحت تكبير 10X وتباين الطور ، ثم تحت تكبير 40X مع تباين الطور والإضاءة الفلورية. ضع جبلا رطبا معدا في كل مرة على مرحلة المجهر وقم بتثبيته في مكانه باستخدام مقاطع مرحلة المجهر ، ثم ابدأ في عرض الحوامل الرطبة بأقل هدف تكبير ، والذي عادة ما يكون 10X واستخدم مجالا ساطعا أو تباين طور لتصور الديدان الخيطية والتركيز عليها.
بمجرد وجود الديدان الخيطية في مجال الرؤية ، ركز عليها باستخدام مقبض التركيز البؤري الدقيق على المجهر ، ثم قم بتحويل الإضاءة إلى التألق عن طريق تدوير القرص وتوجيه الضوء إلى الكاميرا لالتقاط الصور الرقمية. بعد ذلك ، اضبط الإضاءة باستخدام برنامج التصوير بحيث تكون الخلايا العصبية مضاءة بشكل ساطع ، ولكن ليس مشبعة. في مرحلة ما، احصل على صورة منفصلة لمسطرة بنفس تكبير صور الخلية لتوفير مقياس تكبير لشكلها.
تمت دراسة آثار المنغنيز الذي يحتوي على مبيدات الآفات على مورفولوجيا الخلايا العصبية الدوبامين باستخدام سلالة عبرت فيها الخلايا العصبية الدوبامين عن GFP تظهر إشارة ساطعة. ومع ذلك ، فإن إشارة الفلورسنت تبيض إذا تعرضت الخلايا العصبية للضوء لفترات طويلة من الزمن. يمكن أن يكون هذا الإجراء جزءا من مشروع يحركه الطلاب لعدة أسابيع ويمكن أن يتضمن أيضا بيانات سلوكية أو بيانات أخرى.
