Этот протокол является простым и осуществимым способом для студентов бакалавриата проводить аутентичные исследования, которые могут привести к публикуемым результатам. Основным преимуществом является то, что студенты могут проводить оригинальные исследования по вопросам, которые они решают самостоятельно. Для начала сделайте разбрасыватель раствора, аккуратно согнув девятимиллилитровую стеклянную пипетку Пастера в пламя горелки Бунзена и закройте отверстие пипетки.
Затем этанол стерилизуют разбрасыватель перед каждым разбрасыванием на пластине Петри. Используя микропипеттер, поместите 100 микролитров разведения на центр агара и аккуратно распределите по поверхности стерилизованным разбрасывателем. Затем отложите в сторону чашки Петри и дайте раствору впитаться в поверхность до высыхания.
Для периодов воздействия более 12 часов добавьте 50 микролитров ночной культуры кишечной палочки к пластинам перед добавлением нематод, тогда как для острых экспериментов продолжительностью 12 часов или менее нет необходимости иметь E.coli на пластинах. Используя микропипетку, поместите один миллилитр стерильной воды на пластину нематод. Затем разбрызгивайте воду, чтобы поднять нематод, затем удалите жидкость с нематодами в 1,5-миллилитровую микрофьюжную трубку.
Через 10 минут, когда нематоды осядут под действием силы тяжести, аккуратно удалите не менее 500 микролитров воды и выбросьте. Затем повторно суспендируют нематоды и, используя отрезанный желтый наконечник пипетки, удаляют от 50 до 100 микролитров взвешенных червей на каждую пластину обработки, гарантируя, что в каждой пластине будет не менее 10 взрослых червей. Подготовьте два слайда, поместив кусок этикеточной ленты только на одну сторону слайда, чтобы сформировать прокладку равномерной толщины, а затем поместите чистый неиспользуемый слайд между ними на столешнице.
Поместите 10-микролитровую каплю расплавленной агарозы в центр слайда с помощью микропипеттера. Затем сгладите каплю, поместив еще один чистый слайд сверху перпендикулярно слайду с каплей, и приложите давление, чтобы капля агарозы сформировала толщину этикетировочной ленты. После этого приложите постоянное давление, чтобы разделить два слайда.
Затем положите этот слайд агаровой стороной вверх на столешницу и дайте ему высохнуть в течение одной-двух минут перед использованием. Чтобы добавить нематоды подготовленного слайда с агарозной прокладкой, добавьте в агаровую прокладку пятимикролитровую каплю воды, содержащую один молярный азид натрия, которая обезболит червей и мобилизует их. Затем переложить по 10 нематод на один лечебный слайд в капельку с помощью червячной кирки, которую следует стерилизовать до и после переноса нематод.
Затем добавьте крышку с помощью щипцов, поместив ее под углом и медленно опуская. После этого поместите подготовленное мокрое крепление на флуоресцентный микроскоп, чтобы наблюдать червей сначала при 10-кратном увеличении и фазовом контрасте, а затем при 40-кратном увеличении с фазовым контрастом и флуоресцентным освещением. Поместите одно подготовленное мокрое крепление за раз на ступень микроскопа и закрепите на месте с помощью зажимов сцены микроскопа, затем начните просмотр мокрых креплений с наименьшим объективом увеличения, которое обычно составляет 10X, и используйте яркое поле или фазовый контраст для визуализации и фокусировки на нематодах.
Как только нематода находится в поле зрения, сосредоточьтесь на ней с помощью тонкой ручки фокусировки на микроскопе, затем переключите освещение на флуоресценцию, повернув циферблат и направьте свет на камеру для захвата цифровых изображений. Затем отрегулируйте освещение с помощью программного обеспечения для визуализации так, чтобы нейроны были ярко освещены, но не перенасыщены. В какой-то момент получите отдельное изображение линейки с тем же увеличением, что и изображения ячеек, чтобы обеспечить шкалу увеличения для их фигуры.
Было изучено влияние марганца, содержащего пестицид, на морфологию дофаминовых нейронов с использованием штамма, в котором дофаминовые нейроны экспрессировали GFP, показывая яркий сигнал. Тем не менее, флуоресцентный сигнал отбеливает, если нейроны подвергаются воздействию света в течение длительных периодов времени. Эта процедура может быть частью многонедельного студенческого проекта, который также может включать поведенческие или другие данные.
