이 프로토콜은 학부생이 출판 가능한 결과로 이어질 수있는 진정한 연구를 수행 할 수있는 간단하고 실현 가능한 방법입니다. 가장 큰 장점은 학생들이 스스로 결정한 질문에 대한 독창적 인 연구를 수행 할 수 있다는 것입니다. 시작하려면 Bunsen 버너 화염에서 아홉 밀리리터 유리 파스퇴르 피펫을 조심스럽게 구부리고 피펫의 개구부를 닫아 용액 스프레더를 만드십시오.
그런 다음 에탄올은 페트리 플레이트 상에 각각 퍼지기 전에 스프레더를 멸균한다. 마이크로피펫터를 사용하여, 희석액 100 마이크로리터를 한천의 중앙에 놓고 멸균된 스프레더로 표면을 가로질러 부드럽게 퍼뜨린다. 그런 다음 덮은 페트리 접시를 제쳐두고 용액이 건조 될 때까지 표면에 담그십시오.
12 시간 이상의 노출 기간의 경우, 선충류를 첨가하기 전에 Escherichia 콜라이의 하룻밤 배양 50 마이크로 리터를 플레이트에 첨가하는 반면, 12 시간 이하의 급성 실험의 경우 플레이트에 E.coli를 가질 필요가 없습니다. 마이크로 피펫을 사용하여 선충류 접시에 멸균수 한 밀리리터를 놓습니다. 다음으로, 선충류를 들어 올리기 위해 물을 뿌린 다음 선충류가있는 액체를 1.5 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브로 제거하십시오.
10 분 후, 선충류가 중력에 의해 정착됨에 따라 조심스럽게 적어도 500 마이크로 리터의 물을 제거하고 버리십시오. 그런 다음 선충류를 재현탁시키고 컷오프 노란 피펫 팁을 사용하여 각 처리 플레이트에 50 ~ 100 마이크로 리터의 부유 한 웜을 제거하여 각 플레이트에 적어도 10 마리의 성인 웜이 있는지 확인하십시오. 슬라이드의 한쪽에만 라벨 테이프 조각을 배치하여 균일한 두께의 패드를 형성한 다음 사용하지 않은 깨끗한 슬라이드를 벤치탑의 사이에 배치하여 두 개의 슬라이드를 준비합니다.
용융된 아가로오스의 10 마이크로리터 방울을 마이크로피플러를 사용하여 슬라이드의 중앙에 놓는다. 그런 다음 방울이있는 슬라이드에 수직으로 다른 깨끗한 슬라이드를 맨 위에 놓고 압력을 가하여 방울을 평평하게하고 아가로스 방울이 라벨링 테이프의 두께를 형성하도록하십시오. 그런 다음 일정한 압력을 가하여 두 슬라이드를 분리하십시오.
그런 다음이 슬라이드를 한천 쪽을 벤치 탑에 올려 놓고 사용하기 전에 일에서 두 분 동안 말리십시오. 아가로스 패드로 준비된 슬라이드의 선충류를 추가하려면 한 몰 나트륨 아지드가 들어있는 다섯 마이크로 리터의 물방울을 한천 패드에 넣으면 웜을 마취하여 동원합니다. 그런 다음 처리 슬라이드 당 10 선충류를 선충류를 옮기기 전후에 살균해야하는 웜 픽을 사용하여 물방울로 옮깁니다.
그런 다음 포셉을 사용하여 커버 슬립을 비스듬히 놓고 천천히 낮추어 덮개를 추가하십시오. 그 후, 준비된 습식 마운트를 형광 현미경에 올려 놓고 먼저 10X 배율 및 위상 대비 하에서 웜을 관찰 한 다음 위상 대비 및 형광 조명으로 40X 배율 하에서 웜을 관찰하십시오. 현미경 스테이지에 한 번에 하나의 준비된 습식 마운트를 놓고 현미경 스테이지 클립을 사용하여 제자리에 고정시킨 다음 가장 낮은 배율 목표(일반적으로 10X)로 습식 마운트를 보기 시작하고 밝은 필드 또는 위상 대비를 사용하여 선충류를 시각화하고 초점을 맞춥니다.
선충류가 시야에 위치하면 현미경의 미세 초점 노브를 사용하여 초점을 맞춘 다음 다이얼을 돌려 조명을 형광으로 전환하고 빛을 카메라로 보내 디지털 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 이미징 소프트웨어를 사용하여 조명을 조정하여 뉴런이 밝게 비추지 만 과포화되지 않도록하십시오. 어떤 시점에서, 세포 이미지와 동일한 배율로 통치자의 별개의 이미지를 획득하여 그들의 형상에 대한 배율 스케일을 제공한다.
살충제를 함유한 망간이 GFP를 발현하는 균주를 이용한 도파민 뉴런 형태학에 미치는 영향을 연구하여 밝은 신호를 나타내었다. 그러나, 형광 신호는 뉴런이 장시간 빛에 노출되면 표백된다. 이 절차는 행동 또는 기타 데이터를 포함 할 수있는 여러 주간의 학생 주도 프로젝트의 일부가 될 수 있습니다.
