Dieses Protokoll kann anderen Forschern direkte und effektive experimentelle Ansätze und die detaillierten Schritte zur Bewertung der zellulären Reaktionswirksamkeit neuartiger Impfstoffadjuvantien liefern. Es kann den Forschern nicht nur spezifische zelluläre Bewertungsmethoden für Adjuvantien zur Verfügung stellen, sondern auch Extraktionsmethoden wie BM-Erkrankungen aufschlüsseln. Diese Protokolle zeigen nicht nur keine Toxizität und eine hohe zelluläre Abgabe, sondern bieten auch detaillierte Verfahren für die adjuvante Bewertung.
Schalten Sie zunächst das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Nach dem Sammeln eines Röhrchens mit gefrorenen L929-Zellen aus flüssigem Stickstoff schnell im Wasserbad auftauen. Nachdem Sie die Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen pipettiert haben, fügen Sie zwei Milliliter DMEM hinzu und mischen Sie gut.
Die Proben werden fünf Minuten lang bei 129 x g zentrifugiert. Und nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie zwei Milliliter DMEM hinzu, um die Zellen zu resuspendieren. Zentrifugieren Sie die Proben erneut.
Und nachdem der Überstand verworfen wurde, fügen Sie sechs Milliliter DMEM-Vollmedium zur Resuspension hinzu und geben Sie sie in einen T25-Zentimeter-Quadrat-Kulturkolben in einem 37-Grad-Inkubator mit 5% Kohlendioxid für 48 Stunden. Am 24. Tag nach der Grundimmunisierung nehmen Sie die Mäuse aus dem Tierzimmer, legen Sie sie in eine Glasschale und weichen Sie fünf Minuten lang 75% Alkohol ein. Legen Sie die Zentrifugenröhrchen auf ein Zentrifugengestell, nummerieren Sie die Einweg-Petrischalen und geben Sie mit einer 10-Milliliter-Pipette fünf Milliliter PBS in jede Petrischale.
Machen Sie einen sechs bis acht Zentimeter langen Schnitt mit einer Schere in der Mitte der linken Bauchseite der Maus. Reißen Sie die Haut auf, um die Bauchdecke freizulegen und den langen roten Streifen der Milz zu finden. Als nächstes heben Sie das Peritoneum auf der unteren Seite der Milz mit einer Pinzette an.
Schneiden Sie es auf und drehen Sie es nach oben, um die Milz freizulegen. Heben Sie die Milz mit einer Pinzette an. Trennen Sie das Bindegewebe unter der Milz mit einer Augenschere und entfernen Sie die Milz.
Geben Sie die Milz in eine Petrischale mit fünf Millilitern PBS und mahlen Sie sie mit einem Sieb und einem Spritzenkolben. Nach dem Mahlen wird die Flüssigkeit mit einer Pipette entsprechend der Nummerierung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Anschließend wird die Flüssigkeit bei 453 x g fünf Minuten lang zentrifugiert.
Und nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie jedem Röhrchen drei Milliliter Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu. Resuspendieren Sie die Zellen und lysieren Sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann fügen Sie 10 bis 12 Milliliter PBS zu jeder Tube hinzu.
Und nach dem Mischen und Zentrifugieren bei 453 x g für fünf Minuten verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 10 Milliliter PBS in jedes Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie die Zellen. Nehmen Sie 20 Mikroliter jeder Probe in eine Vertiefung der Zellzählplatte und erfassen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit einem automatisierten Zellzähler. Anschließend werden die Proben fünf Minuten lang bei 453 x g zentrifugiert.
Und nach dem Verwerfen des Überstands auf 2,5 x 10 bis sechs Zellen pro Milliliter mit RF10-Medium verdünnen und zu einer 96-Well-Platte bei 100 Mikrolitern pro Vertiefung hinzufügen. Schneiden Sie mit einer Schere einen sechs bis acht Zentimeter langen Schnitt unter dem Bauch der Maus und klemmen Sie die beiden Enden der Öffnung ein, um sie in verschiedene Richtungen zu trennen und die Beine der Maus freizulegen. Trennen Sie den Oberschenkelknochen der Maus vom Körper der Maus und die Tibia vom Gelenk.
Und halten Sie die Knochen an beiden Enden intakt. Als nächstes entfernen Sie das restliche Gewebe und den Knorpel aus den Gelenkgelenken an beiden Enden des Oberschenkelknochens mit Schere und Pinzette. Die Oberschenkelknochen fünf Minuten lang in 75%igem Alkohol einweichen und dann in einer sterilen PBS-Lösung einweichen, um den Oberflächenalkohol abzuwaschen.
Dann schneiden Sie die Enden der Oberschenkelknochen mit einer Schere ab und spülen Sie das Knochenmark in einer sterilen Petrischale mit steriler PBS-Lösung ab, gefolgt von einer Aspiration mit einer Ein-Milliliter-Spritze. Wiederholen Sie das Waschen drei- bis fünfmal. Als nächstes wird mit einem Zellsieb filtriert und die aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gesammelt.
Nach dem Zentrifugieren der Proben bei 290 x g für fünf Minuten wird der Überstand verworfen und vier Milliliter Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzugefügt, resuspendiert und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur lysiert. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter sterile PBS-Lösung hinzu, um das Lysat zu neutralisieren, und verwerfen Sie nach dem Zentrifugieren bei 290 x g für fünf Minuten den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter DMEM, das 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung und 10% fötales Rinderserum enthält, und zählen Sie.
Dann fügen Sie dem Medium den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor plus Interleukin-4 hinzu. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 x 10 auf das Fünftel pro Milliliter ein und impfen Sie die Zellen auf Deckgläsern. Nach Zugabe der Zellsuspension zu einer Sechs-Well-Platte mit zwei Millilitern pro Vertiefung legen Sie die Platte 48 Stunden lang in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Wechseln Sie das Medium nach zwei Tagen vollständig und wechseln Sie die Hälfte des Mediums nach vier Tagen. Tauchen Sie die Mäuse nach der Euthanasie in 75% Alkohol und legen Sie sie mit dem Gesicht nach oben in eine gläserne Petrischale in nummerierter Reihenfolge. Führen Sie die Mäuse durch das Transferfenster in den sterilen Operationssaal und legen Sie sie für fünf Minuten auf den Operationstisch.
Mit der Spritze 10 Milliliter Kochsalzlösung absaugen. Kippen Sie die Mäuse um ca. 45 Grad nach unten und injizieren Sie sie in die Mitte der Bauchhöhle. Pro 10 Milliliter etwa fünf Milliliter Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben und die Injektion dreimal wiederholen.
Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 129 x g für fünf Minuten, um peritoneale primäre Makrophagen der Maus zu erhalten. L929-Fibroblasten sind ein nützliches Screening-Modell für die In-vitro-Toxizitätsprüfung von NOD. Die Quantifizierung der inflammatorischen Zytokinspiegel in der Milz kann Forschern helfen, die Immunantwort besser zu verstehen.
Die Überwachung zytotoxischer T-Lymphozyten mit enzymgebundenem Immunospot ist der Goldstandard für die Beurteilung der antigenspezifischen T-Zell-Immunität in klinischen Studien und für das Screening von Impfstoffkandidaten. Die erhöhte Aufnahme eines Antigens durch dendritische Zellen kann eine verstärkte adaptive Immunantwort hervorrufen. Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Präsentation von Antigenen für T-Zellen sowie bei der Induktion anderer Antigen-präsentierender Zellen, ko-stimulatorische Moleküle zu exprimieren und dadurch adaptive Immunantworten zu initiieren.
Die Isolierung von Zellen unter dem Verhältnis von Wirkstoff- zu Zellwirkung ist von größter Bedeutung.
