Questo protocollo può fornire ad altri ricercatori approcci sperimentali diretti ed efficaci e i passaggi dettagliati per valutare l'efficacia della risposta cellulare di nuovi adiuvanti di vaccino. Non solo può fornire ai ricercatori specifici metodi di valutazione cellulare per gli adiuvanti, ma può anche abbattere i metodi di estrazione come la malattia BM. Questi protocolli non solo dimostrano l'assenza di tossicità e l'elevata somministrazione cellulare, ma forniscono anche procedure dettagliate per il campo di valutazione dell'adiuvante.
Per iniziare, accendere il bagno d'acqua e regolare la temperatura a 37 gradi Celsius. Quindi, dopo aver raccolto un tubo di cellule L929 congelate dall'azoto liquido, scongelare rapidamente a bagnomaria. Dopo aver pipettato le cellule in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri, aggiungere due millilitri di DMEM e mescolare bene.
Centrifugare i campioni a 129 x g per cinque minuti. E dopo aver scartato il surnatante, aggiungere due millilitri di DMEM per risospendere le cellule. Centrifugare nuovamente i campioni.
E dopo aver scartato il surnatante, aggiungere sei millilitri di terreno completo DMEM per la risospensione e trasferito in un pallone di coltura quadrato T25 centimetri in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica in coltura per 48 ore. Il giorno 24 dopo l'immunizzazione primaria, rimuovere i topi dalla stanza degli animali, metterli in un piatto di vetro e immergere il 75% di alcol per cinque minuti. Posizionare i tubi della centrifuga su una griglia del tubo della centrifuga, numerare le piastre di Petri usa e getta e aggiungere cinque millilitri di PBS a ciascuna piastra di Petri con una pipetta da 10 millilitri.
Fai un'incisione da sei a otto centimetri con le forbici nel mezzo del lato ventrale sinistro del mouse. Strappare la pelle per esporre la parete addominale e individuare la lunga striscia rossa della milza. Quindi, sollevare il peritoneo sul lato inferiore della milza con una pinza.
Taglialo aperto e giralo verso l'alto per esporre la milza. Sollevare la milza con una pinza. Separare il tessuto connettivo sotto la milza con forbici oftalmiche e rimuovere la milza.
Mettere la milza in una piastra di Petri contenente cinque millilitri di PBS e macinare con un setaccio e uno stantuffo della siringa. Dopo la macinazione, trasferire il liquido in una provetta da centrifuga da 15 millilitri con una pipetta secondo la numerazione. Quindi, centrifugare il liquido a 453 x g per cinque minuti.
E dopo aver scartato il surnatante, aggiungere tre millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi a ciascun tubo. Risospendere le cellule e lisare a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi aggiungere da 10 a 12 millilitri di PBS a ciascun tubo.
E dopo aver miscelato e centrifugato a 453 x g per cinque minuti, scartare il surnatante e aggiungere 10 millilitri di PBS a ciascuna provetta della centrifuga e risospendere le cellule. Prendi 20 microlitri di ciascun campione in un pozzetto della piastra di conteggio delle cellule e registra il numero di cellule vive utilizzando un contatore automatico delle celle. Quindi, centrifugare i campioni a 453 x g per cinque minuti.
E dopo aver scartato il surnatante, diluire a 2,5 x 10 alla sesta cella per millilitro con mezzo RF10 e aggiungere a una piastra da 96 pozzetti a 100 microlitri per pozzetto. Tagliare un'incisione da sei a otto centimetri sotto l'addome del topo con le forbici e bloccare le due estremità dell'apertura per separarlo in direzioni diverse ed esporre le gambe del topo. Separare il femore del topo dal corpo del topo e la tibia dall'articolazione.
E mantenere intatte le ossa ad entrambe le estremità. Quindi, rimuovere il tessuto residuo e la cartilagine dalle articolazioni articolari ad entrambe le estremità del femore con forbici e pinze. Immergere i femori in alcool al 75% per cinque minuti e quindi immergerli in una soluzione PBS sterile per lavare via l'alcol superficiale.
Quindi tagliare le estremità dei femori con le forbici e sciacquare il midollo osseo in una capsula di Petri sterile con soluzione sterile di PBS, seguita dall'aspirazione con una siringa da un millilitro. Ripetere il lavaggio da tre a cinque volte. Quindi, filtrare con un setaccio cellulare e raccogliere le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo in un tubo da centrifuga da 15 millilitri.
Dopo aver centrifugato i campioni a 290 x g per cinque minuti, scartare il surnatante e aggiungere quattro millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi, risospendere e lisare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, aggiungere 10 millilitri di soluzione PBS sterile per neutralizzare il lisato e, dopo aver centrifugato a 290 x g per cinque minuti, scartare il surnatante. Risospendere le cellule in un millilitro di DMEM contenente 1% soluzione di penicillina-streptomicina e 10% siero fetale bovino e conteggio.
Quindi aggiungere il fattore stimolante le colonie di macrofagi granulocitari più l'interleuchina-4 al mezzo. Regolare la concentrazione cellulare a 5 x 10 al quinto per millilitro e inoculare le cellule sui vetrini di copertura. Dopo aver aggiunto la sospensione della cella a una piastra a sei pozzetti a due millilitri per pozzetto, posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48 ore.
Cambiare completamente il mezzo dopo due giorni e cambiare metà del mezzo dopo quattro giorni. Immergere i topi in alcol al 75% dopo l'eutanasia e metterli a faccia in su in una capsula di Petri di vetro in ordine numerato. Far passare i topi attraverso la finestra di trasferimento nella sala operatoria sterile e posizionarli sul tavolo operatorio per cinque minuti.
Utilizzando la siringa, aspirare 10 millilitri di soluzione salina. Inclinare i topi verso il basso a circa 45 gradi e iniettare nel mezzo della cavità addominale. Aspirare circa cinque millilitri di sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri per ogni 10 millilitri e ripetere l'iniezione tre volte.
Centrifugare la sospensione cellulare a 129 x g per cinque minuti per ottenere macrofagi primari peritoneali di topo. I fibroblasti L929 sono un utile modello di screening per i test di tossicità in vitro di NOD. La quantificazione dei livelli di citochine infiammatorie nella milza può aiutare i ricercatori a comprendere meglio la risposta immunitaria.
Il monitoraggio dei linfociti T citotossici con immunospot enzimatico è il gold standard per valutare l'immunità delle cellule T antigene specifiche negli studi clinici e per lo screening dei candidati vaccini. L'aumento dell'assorbimento di un antigene da parte delle cellule dendritiche può suscitare risposte immunitarie adattative migliorate. I macrofagi svolgono un ruolo importante nella presentazione degli antigeni alle cellule T, oltre a indurre altre cellule presentanti l'antigene ad esprimere molecole co-stimolatorie, avviando così risposte immunitarie adattative.
L'isolamento delle cellule sotto il rapporto tra azione farmacologica e cellula è della massima importanza.
