Ce protocole peut fournir à d’autres chercheurs des approches expérimentales directes et efficaces et les étapes détaillées pour évaluer l’efficacité de la réponse cellulaire des nouveaux adjuvants vaccinaux. Il fournit non seulement aux chercheurs des méthodes d’évaluation cellulaire spécifiques pour les adjuvants, mais peut également décomposer les méthodes d’extraction telles que la maladie BM. Ces protocoles démontrent non seulement l’absence de toxicité et une livraison cellulaire élevée, mais fournissent également des procédures détaillées pour l’évaluation des adjuvants sur le terrain.
Pour commencer, allumez le bain-marie et réglez la température à 37 degrés Celsius. Ensuite, après avoir recueilli un tube de cellules L929 congelées à partir d’azote liquide, décongeler rapidement au bain-marie. Après avoir pipeté les cellules dans un tube centrifuge stérile de 15 millilitres, ajoutez deux millilitres de DMEM et mélangez bien.
Centrifuger les échantillons à 129 x g pendant cinq minutes. Et après avoir jeté le surnageant, ajoutez deux millilitres de DMEM pour remettre les cellules en suspension. Centrifuger à nouveau les échantillons.
Et après avoir jeté le surnageant, ajouter six millilitres de milieu complet DMEM pour la remise en suspension, et transférer dans un ballon de culture carré de 25 centimètres dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone à la culture pendant 48 heures. Le jour 24 après la primovaccination, retirez les souris de la salle animalière, placez-les dans un plat en verre et faites-les tremper dans de l’alcool à 75% pendant cinq minutes. Placez les tubes de centrifugation sur un support à tubes à centrifuger, numérotez les boîtes de Petri jetables et ajoutez cinq millilitres de PBS à chaque boîte de Petri avec une pipette de 10 millilitres.
Faites une incision de six à huit centimètres avec des ciseaux au milieu de la face ventrale gauche de la souris. Déchirez la peau pour exposer la paroi abdominale et localisez la longue bande rouge de la rate. Ensuite, soulevez le péritoine du côté inférieur de la rate avec une pince.
Coupez-le et retournez-le vers le haut pour exposer la rate. Soulevez la rate avec une pince. Séparez le tissu conjonctif sous la rate avec des ciseaux ophtalmiques et retirez la rate.
Placer la rate dans une boîte de Petri contenant cinq millilitres de PBS et broyer avec un tamis et un piston de seringue. Après broyage, transférer le liquide dans un tube centrifuge de 15 millilitres à l’aide d’une pipette conformément à la numérotation. Ensuite, centrifugez le liquide à 453 x g pendant cinq minutes.
Et après avoir jeté le surnageant, ajoutez trois millilitres de tampon de lyse des globules rouges à chaque tube. Remettez les cellules en suspension et lysez à température ambiante pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite 10 à 12 millilitres de PBS à chaque tube.
Et après avoir mélangé et centrifugé à 453 x g pendant cinq minutes, jeter le surnageant et ajouter 10 millilitres de PBS à chaque tube de centrifugation et remettre les cellules en suspension. Prélevez 20 microlitres de chaque échantillon dans un puits de la plaque de comptage des cellules et enregistrez le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé. Ensuite, centrifuger les échantillons à 453 x g pendant cinq minutes.
Et après avoir jeté le surnageant, diluer à 2,5 x 10 à la sixième cellule par millilitre avec un milieu RF10 et ajouter à une plaque de 96 puits à 100 microlitres par puits. Coupez une incision de six à huit centimètres sous l’abdomen de la souris avec des ciseaux et serrez les deux extrémités de l’ouverture pour la séparer dans différentes directions et exposer les pattes de la souris. Séparez le fémur de souris du corps de la souris et le tibia de l’articulation.
Et gardez les os intacts aux deux extrémités. Ensuite, retirez le tissu résiduel et le cartilage des articulations aux deux extrémités du fémur avec des ciseaux et des pinces. Faire tremper les fémurs dans de l’alcool à 75% pendant cinq minutes, puis tremper dans une solution stérile de PBS pour laver l’alcool de surface.
Ensuite, coupez les extrémités des fémurs avec des ciseaux et rincez la moelle osseuse dans une boîte de Petri stérile avec une solution stérile de PBS, suivie d’une aspiration avec une seringue d’un millilitre. Répétez le lavage trois à cinq fois. Ensuite, filtrez par un tamis cellulaire et recueillez les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse dans un tube centrifuge de 15 millilitres.
Après avoir centrifugé les échantillons à 290 x g pendant cinq minutes, jeter le surnageant et ajouter quatre millilitres de tampon de lyse des globules rouges, remettre en suspension et lyser à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de solution PBS stérile pour neutraliser le lysat, et après centrifugation à 290 x g pendant cinq minutes, jetez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre de DMEM contenant 1% de solution de pénicilline-streptomycine et 10% de sérum bovin fœtal et comptez.
Ajoutez ensuite le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires plus l’interleukine-4 au milieu. Ajustez la concentration de la cellule à 5 x 10 à la cinquième par millilitre et inoculez les cellules sur les feuillets de couvercle. Après avoir ajouté la suspension cellulaire à une plaque de six puits à deux millilitres par puits, placez la plaque dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures.
Changez complètement le milieu après deux jours et changez la moitié du milieu après quatre jours. Plongez les souris dans de l’alcool à 75% après l’euthanasie et placez-les face vers le haut dans une boîte de Petri en verre dans l’ordre numéroté. Passez les souris par la fenêtre de transfert dans la salle d’opération stérile et placez-les sur la table d’opération pendant cinq minutes.
À l’aide de la seringue, aspirez 10 millilitres de solution saline. Inclinez les souris vers le bas à environ 45 degrés et injectez au milieu de la cavité abdominale. Aspirez environ cinq millilitres de suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millilitres pour chaque 10 millilitres et répétez l’injection trois fois.
Centrifuger la suspension cellulaire à 129 x g pendant cinq minutes pour obtenir des macrophages primaires péritonéaux de souris. Les fibroblastes L929 sont un modèle de dépistage utile pour les essais de toxicité in vitro du NOD. La quantification des niveaux de cytokines inflammatoires dans la rate peut aider les chercheurs à mieux comprendre la réponse immunitaire.
La surveillance des lymphocytes T cytotoxiques avec immunospot enzymatique est l’étalon-or pour évaluer l’immunité des lymphocytes T spécifiques de l’antigène dans les essais cliniques et pour le criblage des candidats vaccins. L’absorption accrue d’un antigène par les cellules dendritiques peut provoquer des réponses immunitaires adaptatives accrues. Les macrophages jouent un rôle important dans la présentation des antigènes aux lymphocytes T, ainsi que dans l’induction d’autres cellules présentatrices d’antigènes à exprimer des molécules co-stimulantes, initiant ainsi des réponses immunitaires adaptatives.
L’isolement des cellules sous le rapport de l’action médicamenteuse / cellulaire est de la plus haute importance.
