Este protocolo pode fornecer a outros pesquisadores abordagens experimentais diretas e eficazes e as etapas detalhadas para avaliar as eficácias da resposta celular de novos adjuvantes vacinais. Não só pode fornecer aos pesquisadores métodos específicos de avaliação celular para adjuvantes, mas também pode quebrar métodos de extração, como a doença BM. Esses protocolos não apenas demonstram ausência de toxicidade e alta entrega celular, mas também fornecem procedimentos detalhados para o campo de avaliação adjuvante.
Para começar, ligue o banho-maria e ajuste a temperatura para 37 graus Celsius. Então, depois de coletar um tubo de células L929 congeladas de nitrogênio líquido, descongele rapidamente no banho de água. Depois de pipetar as células em um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros, adicione dois mililitros de DMEM e misture bem.
Centrifugar as amostras a 129 x g durante cinco minutos. E depois de descartar o sobrenadante, adicione dois mililitros de DMEM para ressuspender as células. Centrifugar as amostras novamente.
E depois de descartar o sobrenadante, adicionar seis mililitros de meio DMEM completo para resuspensão, e transferido para um frasco de cultura quadrado de T25 centímetros em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono para cultura por 48 horas. No dia 24 após a imunização primária, retire os ratos da sala de animais, coloque-os em um prato de vidro e mergulhe em álcool a 75% por cinco minutos. Coloque os tubos de centrífuga em um rack de tubo de centrífuga, numerado as placas de Petri descartáveis e adicione cinco mililitros de PBS a cada placa de Petri com uma pipeta de 10 mililitros.
Faça uma incisão de seis a oito centímetros com uma tesoura no meio do lado ventral esquerdo do rato. Rasgue a pele para expor a parede abdominal e localize a longa faixa vermelha do baço. Em seguida, levante o peritônio no lado inferior do baço com fórceps.
Corte-o aberto e vire-o para cima para expor o baço. Levante o baço com fórceps. Separe o tecido conjuntivo sob o baço com uma tesoura oftálmica e remova o baço.
Coloque o baço em uma placa de Petri contendo cinco mililitros de PBS e moa com uma peneira e um êmbolo de seringa. Após a moagem, transfira o líquido para um tubo de centrífuga de 15 mililitros com uma pipeta de acordo com a numeração. Em seguida, centrifugar o líquido a 453 x g por cinco minutos.
E depois de descartar o sobrenadante, adicione três mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos a cada tubo. Ressuspenda as células e lise à temperatura ambiente durante 10 minutos. Em seguida, adicione 10 a 12 mililitros de PBS a cada tubo.
E depois de misturar e centrifugar a 453 x g por cinco minutos, descarte o sobrenadante e adicione 10 mililitros de PBS a cada tubo de centrífuga e ressuspenda as células. Pegue 20 microlitros de cada amostra em um poço da placa de contagem de células e registre o número de células vivas usando um contador de células automatizado. Em seguida, centrifugar as amostras a 453 x g por cinco minutos.
E depois de descartar o sobrenadante, diluir para 2,5 x 10 até a sexta célula por mililitro com meio RF10 e adicionar a uma placa de 96 poços a 100 microlitros por poço. Corte uma incisão de seis a oito centímetros abaixo do abdômen do rato com uma tesoura e prenda as duas extremidades da abertura para separá-la em direções diferentes e expor as pernas do rato. Separe o fêmur do rato do corpo do rato e a tíbia da articulação.
E mantenha os ossos intactos em ambas as extremidades. Em seguida, remova o tecido residual e a cartilagem das articulações articulares em ambas as extremidades do fêmur com tesoura e pinça. Mergulhe os fêmures em álcool a 75% por cinco minutos e, em seguida, mergulhe em uma solução estéril de PBS para lavar o álcool da superfície.
Em seguida, corte as extremidades dos fêmures com uma tesoura e enxágue a medula óssea em uma placa de Petri estéril com solução estéril de PBS, seguida de aspiração com uma seringa de um mililitro. Repita a lavagem de três a cinco vezes. Em seguida, filtre por uma peneira celular e colete as células dendríticas derivadas da medula óssea em um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Após centrifugação das amostras a 290 x g durante cinco minutos, eliminar o sobrenadante e adicionar quatro mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos, ressuspender e lisar à temperatura ambiente durante cinco minutos. Em seguida, adicione 10 mililitros de solução estéril de PBS para neutralizar o lisado e, após centrifugar a 290 x g por cinco minutos, descarte o sobrenadante. Ressuspender as células em um mililitro de DMEM contendo solução de 1% de penicilina-estreptomicina e 10% de soro fetal bovino e contagem.
Em seguida, adicione o fator estimulador de colônias de macrófagos de granulócitos mais interleucina-4 ao meio. Ajustar a concentração celular para 5 x 10 para o quinto por mililitro e inocular as células em folhas de cobertura. Depois de adicionar a suspensão celular a uma placa de seis poços a dois mililitros por poço, coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 48 horas.
Mude o meio completamente após dois dias e mude metade do meio após quatro dias. Mergulhe os ratos em álcool a 75% após a eutanásia e coloque-os virados para cima em uma placa de Petri de vidro em ordem numerada. Passe os ratos através da janela de transferência para a sala de operação estéril e coloque-os na mesa de operação por cinco minutos.
Usando a seringa, aspirar 10 mililitros de solução salina. Incline os ratos para baixo a aproximadamente 45 graus e injete no meio da cavidade abdominal. Desenhe cerca de cinco mililitros de suspensão celular em um tubo de centrífuga de 15 mililitros para cada 10 mililitros e repita a injeção três vezes.
Centrifugar a suspensão celular a 129 x g durante cinco minutos para obter macrófagos primários peritoneais de rato. Os fibroblastos L929 são um modelo de triagem útil para o teste de toxicidade in vitro do NOD. A quantificação dos níveis de citocinas inflamatórias no baço pode ajudar os pesquisadores a entender melhor a resposta imune.
O monitoramento de linfócitos T citotóxicos com imunospot enzimático é o padrão-ouro para avaliar a imunidade de células T específicas de antígenos em ensaios clínicos e para triagem de candidatas a vacinas. O aumento da absorção de um antígeno por células dendríticas pode provocar respostas imunes adaptativas aprimoradas. Os macrófagos desempenham um papel importante na apresentação de antígenos às células T, bem como na indução de outras células apresentadoras de antígenos a expressar moléculas coestimulatórias, iniciando assim respostas imunes adaptativas.
O isolamento das células sob a proporção de droga para ação celular é de extrema importância.
