이 프로토콜은 다른 연구자들에게 직접적이고 효과적인 실험적 접근법과 새로운 백신 보조제의 세포 반응 효율성을 평가하기 위한 세부 단계를 제공할 수 있습니다. 연구자에게 보조제에 대한 특정 세포 평가 방법을 제공 할뿐만 아니라 BM 질환과 같은 추출 방법을 분해 할 수도 있습니다. 이 프로토콜은 독성이 없고 높은 세포 전달을 입증할 뿐만 아니라 보조제 평가 분야에 대한 자세한 절차도 제공합니다.
시작하려면 수조를 켜고 온도를 섭씨 37도로 조정하십시오. 그런 다음 액체 질소에서 냉동 L929 세포 튜브를 수집 한 후 수조에서 빠르게 해동합니다. 세포를 15 밀리리터 멸균 원심분리 튜브에 피펫팅한 후, DMEM 2밀리리터를 넣고 잘 혼합합니다.
샘플을 129 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그리고 상청액을 버린 후 2 밀리리터의 DMEM을 추가하여 세포를 재현탁시킵니다. 샘플을 다시 원심분리합니다.
그리고 상청액을 버린 후 재현탁용 DMEM 완전 배지 6밀리리터를 첨가하고 섭씨 37도의 인큐베이터에서 5%이산화탄소가 있는 T25cm 제곱 배양 플라스크로 옮겨 48시간 동안 배양합니다. 1 차 예방 접종 후 24 일째에 동물 방에서 마우스를 꺼내 유리 접시에 넣고 5 분 동안 75 % 알코올에 담그십시오. 원심 분리 튜브를 원심 분리기 튜브 랙에 놓고 일회용 페트리 접시에 번호를 매기고 10 밀리리터 피펫으로 각 페트리 접시에 5 밀리리터의 PBS를 추가합니다.
마우스의 왼쪽 복부 중앙에서 가위로 6-8 센티미터 절개를하십시오. 피부를 찢어 복벽을 노출시키고 비장의 긴 빨간색 스트립을 찾습니다. 다음으로, 집게로 비장의 아래쪽에있는 복막을 들어 올리십시오.
그것을 열고 위로 돌려 비장을 노출시킵니다. 집게로 비장을 들어 올리십시오. 안과 가위로 비장 아래의 결합 조직을 분리하고 비장을 제거하십시오.
5 밀리리터의 PBS가 들어있는 페트리 접시에 비장을 넣고 체와 주사기 플런저로 분쇄하십시오. 분쇄 후, 번호를 매기고 피펫으로 액체를 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 액체를 453 x g에서 5 분 동안 원심 분리한다.
그리고 상청액을 버린 후 각 튜브에 3 밀리리터의 적혈구 용해 완충액을 첨가하십시오. 세포를 재현탁시키고 실온에서 10분 동안 용해시킨다. 그런 다음 각 튜브에 10-12 밀리리터의 PBS를 추가하십시오.
453 x g에서 5분 동안 혼합 및 원심분리한 후, 상청액을 버리고 각 원심분리 튜브에 PBS 10ml를 첨가하고 세포를 재현탁시킨다. 세포 계수 플레이트의 웰에서 각 샘플 20 마이크로 리터를 취하고 자동 세포 카운터를 사용하여 살아있는 세포 수를 기록합니다. 다음으로, 샘플을 453 x g에서 5분 동안 원심분리한다.
상청액을 폐기한 후, 6번째 세포를 RF10 배지로 밀리리터당 2.5 x 10으로 희석하고, 웰당 100 마이크로리터로 96-웰 플레이트에 첨가한다. 가위로 마우스 복부 아래 6-8 센티미터의 절개를 자르고 개구부의 두 끝을 고정하여 다른 방향으로 분리하고 마우스 다리를 노출시킵니다. 마우스 대퇴골을 마우스 몸에서, 경골을 관절에서 분리하십시오.
그리고 양쪽 끝에서 뼈를 그대로 유지하십시오. 다음으로 가위와 집게로 대퇴골 양쪽 끝의 관절 관절에서 잔여 조직과 연골을 제거하십시오. 대퇴골을 75 % 알코올에 5 분 동안 담근 다음 멸균 PBS 용액에 담가 표면 알코올을 씻어냅니다.
그런 다음 가위로 대퇴골의 끝을 잘라 내고 멸균 PBS 용액으로 멸균 된 페트리 접시에서 골수를 헹구고 1 밀리리터 주사기로 흡인합니다. 세척을 3-5 회 반복하십시오. 다음으로, 세포 체로 여과하고 골수 유래 수지상 세포를 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 모은다.
샘플을 290 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 버리고 4밀리리터의 적혈구 용해 완충액을 첨가하고, 재현탁시키고, 실온에서 5분 동안 용해시킨다. 다음으로, 10 밀리리터의 멸균 PBS 용액을 첨가하여 용해물을 중화시키고, 290 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 버린다. 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액과 10% 태아 소 혈청을 포함하는 DMEM 1밀리리터에 세포를 재현탁하고 계수합니다.
그런 다음 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자와 인터루킨 -4를 배지에 첨가하십시오. 세포 농도를 밀리리터당 5 x 10에서 5로 조정하고 커버 슬립에 세포를 접종합니다. 세포 현탁액을 웰당 2밀리리터의 6웰 플레이트에 추가한 후 플레이트를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 넣고 5%이산화탄소를 48시간 동안 넣습니다.
2일 후에 배지를 완전히 교체하고 4일 후에 배지의 절반을 교체하십시오. 안락사 후 생쥐를 75%알코올에 담그고 앞면이 위로 향하도록 유리 페트리 접시에 번호를 매긴 순서대로 놓습니다. 마우스를 이송 창을 통해 멸균 수술실로 통과시키고 5 분 동안 수술대에 놓습니다.
주사기를 사용하여 10 밀리리터의 식염수를 흡인하십시오. 마우스를 약 45도 아래로 기울이고 복강 중앙에 주사하십시오. 각 10 밀리리터에 대해 15 밀리리터의 원심 분리 튜브에 약 5 밀리리터의 세포 현탁액을 넣고 주입을 세 번 반복하십시오.
세포 현탁액을 129 x g에서 5분 동안 원심분리하여 마우스 복막 1차 대식세포를 얻었다. L929 섬유아세포는 NOD의 시험관내 독성 시험을 위한 유용한 스크리닝 모델이다. 비장의 염증성 사이토카인 수치의 정량화는 연구자들이 면역 반응을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
효소 결합 면역반점으로 세포독성 T 림프구를 모니터링하는 것은 임상 시험에서 항원 특이적 T 세포 면역을 평가하고 백신 후보를 선별하기 위한 황금 표준입니다. 수지상 세포에 의한 항원의 증가 된 흡수는 향상된 적응 면역 반응을 이끌어 낼 수 있습니다. 대식세포는 T 세포에 항원을 제시하고 다른 항원 제시 세포가 공동 자극 분자를 발현하도록 유도하여 적응 면역 반응을 시작하는 데 중요한 역할을 합니다.
약물 대 세포 작용의 비율에 따른 세포의 분리가 가장 중요합니다.
