このプロトコルは、他の研究者に直接的かつ効果的な実験的アプローチと、新規ワクチンアジュバントの細胞応答の有効性を評価するための詳細な手順を提供することができます。アジュバントの特定の細胞評価方法を研究者に提供するだけでなく、BM疾患などの抽出方法を分解することもできます。このプロトコルは、毒性がなく、高い細胞送達を実証するだけでなく、アジュバント評価分野の詳細な手順も提供します。
開始するには、ウォーターバスをオンにして、温度を摂氏37度に調整します。次に、液体窒素から凍結L929細胞のチューブを回収した後、水浴中で素早く解凍する。細胞を15ミリリットルの滅菌遠心チューブにピペッティングした後、2ミリリットルのDMEMを加えてよく混合します。
サンプルを129 x gで5分間遠心分離します。そして上清を捨てた後、2ミリリットルのDMEMを加えて細胞を再懸濁します。サンプルを再度遠心分離します。
そして上清を捨てた後、再懸濁用のDMEM完全培地を6ミリリットル加え、5%二酸化炭素を入れた37°Cインキュベーター内のT25センチメートル四方の培養フラスコに移し、48時間培養した。一次免疫後24日目に、マウスを動物室から取り出し、ガラス皿に入れ、75%アルコールに5分間浸します。遠心チューブを遠心チューブラックに置き、使い捨てのペトリ皿に番号を付け、10ミリリットルのピペットで各ペトリ皿に5ミリリットルのPBSを追加します。
マウスの左腹側の中央にハサミで6〜8センチの切開を行います。皮膚を引き裂いて腹壁を露出させ、脾臓の長い赤い帯を見つけます。次に、鉗子で脾臓の下側の腹膜を持ち上げます。
それを切り開いて上向きにし、脾臓を露出させます。鉗子で脾臓を持ち上げます。眼科用ハサミで脾臓の下の結合組織を分離し、脾臓を取り除きます。
脾臓を5ミリリットルのPBSを含むペトリ皿に入れ、ふるいとシリンジプランジャーで粉砕します。粉砕後、番号付けに従ってピペットで液体を15ミリリットルの遠沈管に移します。次に、液体を453 x gで5分間遠心分離します。
そして上清を捨てた後、各チューブに3ミリリットルの赤血球溶解バッファーを加える。細胞を再懸濁し、室温で10分間溶解する。次に、各チューブに10〜12ミリリットルのPBSを追加します。
そして、453 x gで5分間混合および遠心分離した後、上清を廃棄し、各遠沈管に10ミリリットルのPBSを加えて細胞を再懸濁します。細胞計数プレートのウェルに各サンプル20マイクロリットルを採取し、自動セルカウンターを使用して生細胞数を記録します。次に、サンプルを453 x gで5分間遠心分離します。
そして上清を捨てた後、RF10培地で1ミリリットルあたり2.5 x 10から6番目の細胞に希釈し、ウェルあたり100マイクロリットルで96ウェルプレートに加えます。マウスの腹部の下の6〜8センチメートルの切開をハサミで切り、開口部の両端をクランプして異なる方向に分離し、マウスの脚を露出させます。マウスの大腿骨をマウスの体から、脛骨を関節から分離します。
そして、両端の骨を無傷に保ちます。次に、大腿骨両端の関節関節から残留組織と軟骨をハサミと鉗子で取り除きます。大腿骨を75%アルコールに5分間浸してから、滅菌PBS溶液に浸して表面のアルコールを洗い流します。
次に、ハサミで大腿骨の端を切り取り、滅菌PBS溶液を含む滅菌ペトリ皿で骨髄をすすぎ、続いて1ミリリットルの注射器で吸引します。洗浄を3〜5回繰り返します。次に、細胞ふるいでろ過し、骨髄由来樹状細胞を15ミリリットルの遠沈管に回収します。
サンプルを290 x gで5分間遠心分離した後、上清を廃棄し、4ミリリットルの赤血球溶解バッファーを加え、室温で5分間再懸濁して溶解します。次に、10ミリリットルの滅菌PBS溶液を加えてライセートを中和し、290 x gで5分間遠心分離した後、上清を廃棄します。1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液と10%ウシ胎児血清およびカウントを含む1ミリリットルのDMEMに細胞を再懸濁します。
次に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とインターロイキン-4を培地に加えます。細胞濃度をミリリットルあたり5 x 10から5分の1に調整し、カバースリップに細胞を接種します。細胞懸濁液をウェル当たり2ミリリットルで6ウェルプレートに添加した後、プレートを5%二酸化炭素を含む摂氏37度の加湿インキュベーターに48時間入れる。
2日後に培地を完全に交換し、4日後に培地の半分を交換します。安楽死後、マウスを75%アルコールに浸し、番号順にガラスのペトリ皿に表向きに置きます。マウスを移送窓から滅菌手術室に通し、手術台に5分間置きます。
注射器を使用して、10ミリリットルの生理食塩水を吸引します。マウスを約45度で下に傾け、腹腔の中央に注入します。約5ミリリットルの細胞懸濁液を10ミリリットルごとに15ミリリットルの遠沈管に引き込み、注射を3回繰り返します。
細胞懸濁液を129 x gで5分間遠心分離し、マウス腹膜一次マクロファージを得た。L929線維芽細胞は、NODのin vitro毒性試験のための有用なスクリーニングモデルである。脾臓の炎症性サイトカインレベルの定量化は、研究者が免疫応答をよりよく理解するのに役立ちます。
酵素結合イムノスポットによる細胞傷害性Tリンパ球のモニタリングは、臨床試験における抗原特異的T細胞免疫の評価やワクチン候補のスクリーニングのためのゴールドスタンダードです。樹状細胞による抗原の取り込みの増加は、増強された適応免疫応答を誘発することができる。マクロファージは、T細胞に抗原を提示するだけでなく、他の抗原提示細胞が共刺激分子を発現するように誘導し、それによって適応免疫応答を開始する上で重要な役割を果たします。
薬物と細胞作用の比率下での細胞の単離は最も重要である。
