体外 纳米乳剂疫苗佐剂蛇腓磷素D的细胞活性评价

该协议可以为其他研究人员提供直接有效的实验方法和详细步骤，以评估新型疫苗佐剂的细胞反应有效性。它不仅可以为研究人员提供佐剂的特定细胞评估方法，还可以分解BM病等提取方法。该协议不仅证明无毒性和高细胞递送，而且还为佐剂评估领域提供了详细的程序。

首先，打开水浴并将温度调节到37摄氏度。然后从液氮中收集一管冷冻的L929细胞后，在水浴中快速解冻。将细胞移液到15毫升无菌离心管中后，加入两毫升DMEM并充分混合。

将样品以129 x g 离心五分钟。弃去上清液后，加入两毫升DMEM重悬细胞。再次离心样品。

弃去上清液后，加入6毫升DMEM完全培养基进行重悬，并转移到含有5%二氧化碳的37摄氏度培养箱中的T25平方厘米培养瓶中培养48小时。在初次免疫后的第24天，将小鼠从动物室中取出，将其放入玻璃盘中，并在75%酒精中浸泡五分钟。将离心管放在离心管架上，对一次性培养皿进行编号，并用10毫升移液管向每个培养皿中加入5毫升PBS。

在小鼠左腹侧中间用剪刀做一个六到八厘米的切口。撕开皮肤，露出腹壁，找到脾脏的长红色条带。接下来，用镊子提起脾脏下侧的腹膜。

切开并向上翻转以露出脾脏。用镊子提起脾脏。用眼科剪刀分离脾脏下方的结缔组织，取出脾脏。

将脾脏放入含有五毫升PBS的培养皿中，并用筛子和注射器柱塞研磨。研磨后，按照编号将液体转移到带有移液管的15毫升离心管中。接下来，将液体以453 x g 离心五分钟。

弃去上清液后，向每管中加入三毫升红细胞裂解缓冲液。重悬细胞并在室温下裂解10分钟。然后在每个试管中加入 10 至 12 毫升 PBS。

混合并以453×g离心五分钟后，弃去上清液，向每个离心管中加入10毫升PBS并重悬细胞。在细胞计数板的孔中取20微升每个样品，并使用自动细胞计数器记录活细胞的数量。接下来，将样品以453 x g 离心五分钟。

弃去上清液后，用RF10培养基稀释至每毫升2.5×10至第六个细胞，并以每孔100微升的速度加入96孔板中。用剪刀在小鼠腹部下方切一个六到八厘米的切口，夹住开口的两端，使其向不同方向分开，露出老鼠的腿。将小鼠股骨与小鼠身体分开，将胫骨与关节分开。

并保持两端的骨头完好无损。接下来，用剪刀和镊子从股骨两端的关节中去除残留的组织和软骨。将股骨浸泡在 75% 酒精中五分钟，然后浸泡在无菌 PBS 溶液中以洗去表面酒精。

然后用剪刀剪掉股骨的末端，并在无菌PBS溶液的无菌培养皿中冲洗骨髓，然后用一毫升注射器抽吸。重复洗涤三到五次。接下来，通过细胞筛过滤并将骨髓来源的树突状细胞收集到15毫升离心管中。

将样品以290×g离心5分钟后，弃去上清液并加入4毫升红细胞裂解缓冲液，重悬并在室温下裂解5分钟。接下来，加入10毫升无菌PBS溶液以中和裂解物，并以290×g离心五分钟后，弃去上清液。将细胞重悬于含有1%青霉素 - 链霉素溶液和10%胎牛血清的一毫升DMEM中并计数。

然后将粒细胞巨噬细胞集落刺激因子加白细胞介素-4加入培养基中。将细胞浓度调节至每毫升5 x 10至五分之一，并在盖玻片上接种细胞。将细胞悬液以每孔2毫升的速度加入六孔板后，将板置于37摄氏度的加湿培养箱中，用5%二氧化碳放置48小时。

两天后完全更换培养基，四天后更换一半培养基。安乐死后将小鼠浸入75%酒精中，并按编号顺序将它们面朝上放入玻璃培养皿中。将小鼠通过转移窗口进入无菌手术室，并将它们放在手术台上五分钟。

使用注射器吸出10毫升盐水。将小鼠向下倾斜约45度并注射到腹腔中间。每10毫升将约5毫升细胞悬液吸入15毫升离心管中，重复注射三次。

将细胞悬液以129×g离心5分钟，以获得小鼠腹膜原代巨噬细胞。L929成纤维细胞是NOD体外毒性测试的有用筛选模型。量化脾脏中的炎性细胞因子水平可以帮助研究人员更好地了解免疫反应。

使用酶联免疫斑点监测细胞毒性 T 淋巴细胞是在临床试验中评估抗原特异性 T 细胞免疫和筛选候选疫苗的金标准。树突状细胞对抗原摄取的增加可以引发增强的适应性免疫反应。巨噬细胞在向T细胞呈递抗原以及诱导其他抗原呈递细胞表达共刺激分子方面起着重要作用，从而启动适应性免疫反应。

在药物与细胞作用的比例下分离细胞至关重要。