يعد عد وحدات تشكيل المستعمرات ، أو CFUs ، تقنية قياسية في علم الأحياء الدقيقة ، لكنها بطيئة وتتطلب الكثير من ألواح الآجار. توفر تقنيتنا ميزة مائة ضعف على طرق عد CFU التقليدية في كل من لوحات أجار الوقت. لقد طبقنا المنهجية لقياس ميكروبيوم الأمعاء لنماذج الحيوانات الصغيرة ، وخاصة ذباب الفاكهة.
هذا البروتوكول هو طريقة بسيطة وسريعة وآلية لتحديد CFUs في ذباب gnotobiotics. يوفر هذا البروتوكول سير عمل مع أجهزة مصنعة DIY لتصوير وحدات CFU والبرامج المخصصة لأتمتة عدها. يمكن استخدام هذا البروتوكول في أي تجربة في علم الأحياء الدقيقة حيث يمكن أن تكون الطرق الأكثر كفاءة للطلاء وعد CFU مفيدة.
يتطلب التعامل مع الذباب بكفاءة واكتشاف اللوحات براعة يدوية ، لذلك يجب ممارسة ذلك. يتطلب استخدام برنامج العد الآلي حكما حول العتبة ، لذلك يجب مقارنة الإيصالات بالعد اليدوي لتحديد أفضل المعلمات لتجربتك سيكون Ren Dodge ، الباحث من مختبري الذي طور هذه التقنية ، يوضح الإجراء ذلك. للبدء ، صب حبات زجاجية 0.5 ميكرون على صينية قياس الخرزة.
انشر الخرز على الدرج بحيث تمتلئ جميع الآبار وتسويتها. ثم قم بإزالة الخرز الزائد في أنبوب مخروطي. الآن ، ضع لوحة PCR شبه ملتفة رأسا على عقب على صينية القياس وقم بمحاذاتها مع الآبار عن طريق تركيبها في المسافة البادئة على درج القياس.
ثم اقلبها بسرعة لنقل الخرز. قم بإزالة الخرز الزائد من سطح لوحة PCR. تأكد من أن جميع الآبار تحتوي على الخرز.
إذا لزم الأمر ، استخدم مغرفة وزن لإضافة حبات إلى بئر واحدة. ثم قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم والأوتوكلاف. قبل استخدام اللوحة ، أضف 100 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر مباشرة قبل إضافة الذباب باستخدام آلة السحب ذات 96 قناة.
لتعقيم الذباب المخدر على السطح ، انقل الذباب من القارورة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر باستخدام قمع صغير. رش على الفور ملليلتر واحد من 70٪ من الإيثانول في الأنبوب ، وأغلق الأنبوب ، واخلطه بالانقلاب لمدة 10 ثوان. بعد ذلك ، قم بشفط الإيثانول باستخدام ماصة P-1000 مع تجنب استنشاق أي ذباب.
بعد غسل PBS النهائي ، أغلق الأنبوب واضغط عليه بقوة على المقعد عدة مرات مع وضع جانب الغطاء لأسفل حتى يدخل الذباب في الغطاء. بعد فتح الأنبوب ، قم بتوزيع الذباب في الآبار باستخدام ملقط وضع ذبابة واحدة في كل بئر. حافظ على تخدير الذباب عن طريق إبقاء الطبق على الجليد أثناء التحميل.
قم بإزالة الخرز الشارد بالقرب من الآبار ، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى كسر ختم الرقاقة والتسبب في التسرب. تأكد من أن الجانب الباهت من رقائق الختم موجه لأسفل على اللوحة وأن الجانب اللامع مواجه لأعلى نحو مانع التسرب الحراري. اضغط على مانع التسرب الحراري بإحكام لمدة خمس ثوان وقم بتلميعه باستخدام قضيب اليد لتأمين الرقاقة.
تجانس الذباب لمدة خمس دقائق. تأكد من أن الذباب متجانس تماما وأن المحلول يتحول إلى لون. لإزالة السائل من رقائق الختم ، قم بتدوير لوحة الخرز لأسفل لمدة 30 ثانية في لوحة دوارة صغيرة عند 350 جم ، وقم بإزالة الرقاقة أثناء الإمساك باللوحة لتجنب تناثر قطرات من تجانس الذباب.
ضع ثلاث لوحات نمو مستطيلة MRS agar مع فتح أغطيتها في خزانة السلامة الحيوية لتجف لمدة 10 دقائق على الأقل. قم بإعداد لوحين للتخفيف عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر من لوحة معقمة ذات 96 بئرا باستخدام ماصة 96 قناة. قم بتحميل رف من أطراف P-20 على آلة السحب ذات 96 قناة.
قم بعمل تخفيف بنسبة 1:10 عن طريق استنشاق 11.1 ميكرولتر من التجانس من لوحة العينة. الآن ، قم بتوزيعه في أول لوحة تخفيف تحتوي على 100 ميكرولتر من PBS المعقم لكل بئر. احتفظ بلوحة التخفيف على شاكر اللوحة لمدة 10 ثوان عند 600 دورة في الدقيقة.
امزج مرة أخرى عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل. انقل 11.1 ميكرولتر من لوحة التخفيف الأولى إلى لوحة التخفيف الثانية وكرر خطوات الخلط لأي تخفيفات أخرى. لاكتشاف الألواح ، قم بتحميل ميكرولتر من كل بئر في آلة السحب ذات 96 قناة.
اخفض رأس آلة التقطيع ببطء على الطبق ، وتجنب الطعن في الآجار ، وتأكد من توزيع جميع البقع. بعد ذلك ، تأكد من أن البقع السائلة تنقع بسرعة في الآجار ولا تعمل معا. كرر عملية الطلاء لألواح التخفيف المتبقية كما هو موضح في المخطوطة.
بمجرد امتصاص السائل بالكامل في الأجار ، اقلب الألواح واحتضانها حتى تصل المستعمرات إلى الحجم الأمثل. تنظيم اللوحات بشكل منطقي والاحتفاظ بها في ترتيب معين أثناء التصوير. قم بتوجيهها بحيث يكون A1 في الزاوية اليسرى العليا لجميع اللوحات.
بعد إزالة غطاء اللوحة ، ضع اللوحة على المسرح مع توجيه A1 في الزاوية الصحيحة. صورة اللوحات. انقل الصور إلى جهاز كمبيوتر وأعد تسميتها ، بما في ذلك اسم التجربة ونوع الوسائط وعامل التخفيف والتفاصيل الأخرى ذات الصلة.
تنظيم الصور المراد معالجتها للقياس الكمي في مجلد. تصبح أسماء الملفات التي تميز اللوحات عناوين أعمدة لكل مجموعة من الأعداد في جدول بيانات المخرجات. قم بإنشاء مجلدات فرعية باسم اقتصاص والإيصالات في المجلد.
ستتلقى هذه المجلدات ملفات الإخراج. الآن قم بتشغيل المكون الإضافي Croptacular من ImageJ وانقر فوق "موافق" لبدء الاقتصاص. سيظهر مربع حوار لاختيار المجلد المصدر.
انقر فوق موافق. حدد المجلد المصدر وانقر فوق فتح. ثم انقر فوق "موافق" في مربع الحوار لاختيار الدليل الوجهة. حدد المجلد الوجهة واضغط على فتح.
إذا كانت الصورة مستقيمة بالفعل ، فما عليك سوى الضغط على Space. خلاف ذلك ، قم بتصويب الصورة عن طريق رسم خط على طول حافة يجب أن تصبح أفقية. أعد رسم الخط عدة مرات حسب الحاجة إذا لم تظهر الصورة بشكل مستقيم.
بعد ذلك ، ارسم مربعا حدوديا لمنطقة العد واضبط حجمه ونسبته حتى تصبح جميع البقع داخل خلاياها. اسحب المؤشر خارج مربع الحدود لتحديث الشبكة. عندما تبدو الشبكة جيدة، اضغط على Space.
نظرا لأن المكون الإضافي يفترض محاذاة جميع الصور بشكل متطابق ، فتأكد من أن الصورة التالية تدور تلقائيا إلى نفس زاوية الصورة الأولى. إذا كان هذا دقيقا، فاضغط على مفتاح المسافة للمتابعة. خلاف ذلك ، قم بتصويب الصورة كما كان من قبل.
تتذكر الشبكة أيضا نفس موضع الصورة السابقة. اضبط إذا لزم الأمر واضغط على المسافة. قم بتشغيل Count-On-It وحدد Gridiron.
قم بتعيين كثافة مستعمرة العتبة بناء على قيمة كثافة البكسل العلوية والسفلية. اجعل العتبة صارمة قدر الإمكان ، مع الاستمرار في اختيار جميع المستعمرات. انقر فوق موافق في مربع الحوار الإجراء المطلوب عندما يكون الحد مرضيا، ثم انقر فوق موافق للمتابعة.
في الصورة الأولى ، يتم إعطاء الخيار للمتابعة أو العودة إلى قائمة الإعداد. لمتابعة عملية الدفعات، انقر فوق موافق. ثم حدد مجلدا للاحتفاظ بجدول الإيصالات والنتائج. استخدم مجلد الإيصالات الذي تم إنشاؤه مسبقا.
بعد الصورة الأولى ، سيتم تعيين الصور التالية افتراضيا على نفس عتبة الإعدادات السابقة. انقر فوق موافق لاستخدام هذه الإعدادات أو ضبط الإعدادات. راجع إيصالات العد التي ينتجها البرنامج وقم بتصحيح أي أخطاء عد يدويا.
المكون الإضافي ImageJ دقيق إحصائيا ، ولكن تحدث أخطاء. إثبات الإيصالات لفحص القيم المتطرفة وتحديد العد الخاطئ. يحفظ البرنامج بيانات CFU كملف CSV في نفس المجلد مثل الإيصالات.
بالنسبة للذباب المستعمر ب Lactobacillus plantarum ، كان هناك انخفاض كبير في البكتيريا للذباب التي إما تم نقلها يوميا إلى طعام معقم ، أو نقلها يوميا ، أو الاحتفاظ بها على طعام معقم قبل أربع ساعات من التحليل ، أو نقلها يوميا والاحتفاظ بها على أجار معقم قبل أربع ساعات من التحليل مقارنة بالذباب الذي لم يتم نقله أبدا إلى طعام معقم بعد التلقيح. لوحظت نتائج مماثلة في الذباب الذي يتغذى على Acetobacter indonesiensis ، حيث أظهر الذباب المنقول ، وبعد النقل ، والذباب الذي تم تطهيره انخفاضا كبيرا في CFUs ، لكن الغسيل لم يكن له تأثير قابل للقياس ، مما يشير إلى أن الانخفاض في CFUs كان بسبب إزالة البكتيريا من الأمعاء بدلا من بشرة. لم يظهر عدد CFU في البقع التي تحتوي على 2 إلى 25 مستعمرة لكل بقعة أي فرق مقارنة بالطريقة التقليدية.
أظهرت البقع التي يبلغ متوسطها 35 مستعمرة وحدات CFU أقل من لوحات انتشار التحكم. قد يكون هذا الانخفاض بسبب تداخل المستعمرات في البقع الكثيفة. في صور اللوحة ، كانت كثافة المستعمرة أعلى بنسبة 300٪ من الخلفية.
أظهرت المستعمرات الموجبة Lactobacillus plantarum mCherry كثافة حمراء أعلى بنسبة 1،000٪ من المستعمرات السلبية mCherry. أظهرت مستعمرات Acetobacter indonesiensis الإيجابية GFP كثافة خضراء أعلى بنسبة 200٪ من المستعمرات السلبية ل GFP. يقوم المكون الإضافي Count-On-It ل ImageJ بأتمتة عد CFU من صور اللوحة.
يتم الكشف عن المستعمرات بدقة ، مع أعداد مماثلة للعد اليدوي. يمكن استخدام إيصالات العد لتحديد العد الخاطئ. يسمح تغيير عتبات الحجم والأطوال الموجية الفلورية بحساب أشكال مستعمرة مختلفة بشكل منفصل.
من الضروري التأكد من أن اللوحة محكمة الغلق قبل خرزها. من المهم أيضا تصميم عناصر تحكم إيجابية لمعايرة قياساتك. نستخدم هذه التقنية أيضا لدراسة مجموعات البكتيريا في المختبر في 96 لوحة بئر ، مما يتيح لنا دراسة المجتمعات المختلطة من البكتيريا.
تسمح هذه التقنية بنهج فحص عالية الإنتاجية لقياس استعمار الأمعاء وكذلك التباين البيولوجي في الاستعمار.
