计数菌落形成单位（CFU）是微生物学的标准技术，但它很慢，需要大量的琼脂平板。在两种时间琼脂平板中，我们的技术与传统的CFU计数方法相比具有一百倍的优势。我们已经应用该方法来测量小动物模型的肠道微生物组，特别是果蝇。
该协议是一种简单，快速和自动化的方法来量化gnotobiotics苍蝇中的CFU。该协议提供了一个工作流程，其中包含DIY制造的仪器来拍摄CFU和定制软件以自动计数它们。该协议可用于任何微生物学实验，其中更有效的电镀和CFU计数方法可能是有用的。
有效地处理苍蝇和发现板需要手动灵巧，因此应该练习。使用自动计数软件需要判断阈值，因此应将收据与手动计数进行比较，以确定实验的最佳参数 演示该程序的将是我实验室的研究人员Ren Dodge，他开发了这项技术。首先，将 0.5 微米的玻璃珠倒入珠子测量托盘上。
将珠子铺在托盘上，使所有孔都充满并平整。然后，将多余的珠子刷入锥形管中。现在，将半裙边PCR板倒置在测量托盘上，并通过将其安装到测量托盘上的压痕中将其与孔对齐。
然后，快速将其翻转以转移珠子。从PCR板表面去除多余的珠子。确保所有孔都含有珠子。
如果需要，使用称量勺将珠子添加到单个孔中。然后，用铝箔和高压釜盖住板。在使用板之前，在使用96通道移液器添加苍蝇之前，立即向每个孔中加入100微升PBS。
为了对麻醉的苍蝇进行表面灭菌，使用小漏斗将苍蝇从小瓶转移到1.5毫升微量离心管中。立即将一毫升70%乙醇喷入试管中，关闭试管，倒置混合10秒。然后，用P-1000移液管吸出乙醇，同时避免吸出任何苍蝇。
最后一次PBS清洗后，关闭管子并在工作台上用力敲击几次，盖子朝下，使苍蝇进入盖子。打开试管后，用镊子将苍蝇分配到孔中，并在每个孔中放置一只苍蝇。通过在装载时将板放在冰上来保持苍蝇麻醉。
清除靠近孔的杂散珠子，因为这些珠子会破坏箔密封并导致泄漏。确保密封箔的钝面朝下放在板上，反光的一面朝上朝向热封机。用力按压热封机五秒钟，然后用手涂抹器抛光以固定箔纸。
将苍蝇均匀化五分钟。确保苍蝇完全均质化，溶液变色。要从密封箔中去除液体，请在350 G的迷你板旋转器中旋转珠板30秒.在握住板的同时取出箔纸，以避免飞人均质液滴飞溅。
将三个矩形MRS琼脂生长板打开盖子放在生物安全柜中干燥至少10分钟。通过使用 96 通道移液器向无菌 96 孔板的每个孔中加入 100 微升 PBS，准备两个稀释板。将 P-20 吸头架装入 96 通道移液器上。
通过从样品板中吸取 11.1 微升匀浆进行 1：10 稀释。现在，将其分配到每孔含有100微升无菌PBS的第一个稀释板中。将稀释板在摇板器上以600 RPM保持10秒钟。
通过上下移液至少 10 次再次混合。将11.1微升从第一个稀释板转移到第二个稀释板，并重复混合步骤以进行任何进一步的稀释。对于点样板，将每个孔中的两微升装入 96 通道移液器中。
将移液器头缓慢放到盘子上，避免刺入琼脂，并确保所有斑点都已分配。然后，检查液体斑点是否快速浸入琼脂中并且不要一起运行。按照手稿中的说明对剩余的稀释板重复电镀过程。
一旦液体完全吸收到琼脂中，倒置板并孵育它们，直到菌落达到最佳大小。合乎逻辑地组织图版，并在拍摄时按特定顺序保存它们。调整它们的方向，使 A1 位于所有板的左上角。
取下板盖后，将板放在载物台上，A1朝向正确的角落。对板进行成像。将图像传输到计算机并重命名它们，包括实验名称、培养基类型、稀释因子和其他相关详细信息。
将要处理以进行量化的图像组织到一个文件夹中。区分印版的文件名将成为输出电子表格中每组计数的列标题。在文件夹中创建名为“裁剪”和“收据”的子文件夹。
这些文件夹将接收输出文件。现在从 ImageJ 启动裁剪插件并单击确定开始裁剪。将弹出一个用于选择源文件夹的对话框。
单击“确定”。选择源文件夹，然后单击“打开”。然后，在对话框中单击“确定”以选择目标目录。选择目标文件夹，然后按打开。
如果图像已经是直的，只需按空格键即可。否则，通过沿应变为水平的边缘绘制一条线来拉直图像。如果图像不笔直，请根据需要多次重绘线条。
接下来，为计数区域绘制一个边界框并调整其大小和比例，直到所有点都在其单元格内。将光标拖到边界框外以刷新网格。当网格看起来不错时，按空格键。
由于该插件假定所有照片都以相同的方式对齐，因此请确保下一张图像自动旋转到与第一张图像相同的角度。如果这是准确的，请按空格键继续。否则，请像以前一样拉直图像。
网格还会调用与上一个图像相同的位置。如有必要，请进行调整，然后按空格键。启动计数并选择烤架。
根据像素强度上限和下限像素强度值设置阈值菌落强度。使阈值尽可能严格，同时仍然选择所有菌落。当阈值满足时，单击“所需操作”对话框中的“确定”，然后单击“确定”继续。
在第一个图像上，提供了继续或返回设置菜单的选项。要继续批处理，请单击“确定”。然后，选择一个文件夹来保存收据和结果表。使用之前创建的“收据”文件夹。
在第一个图像之后，以下图像将默认为与先前设置相同的阈值。单击“确定”使用这些设置或调整设置。查看软件生成的盘点收据，并手动更正任何盘点错误。
ImageJ 插件在统计上是准确的，但确实会发生错误。证明收据以检查异常值并识别错误计数。该软件将CFU数据作为CSV文件保存在与收据相同的文件夹中。
对于植物乳杆菌定植的苍蝇，与接种后从未转移到无菌食物中的苍蝇相比，每天转移到无菌食物中，每天转移，在分析前四小时保持无菌食物，或每天转移并在分析前四小时保存在无菌琼脂上的苍蝇的细菌显着减少。在以印度尼西亚醋杆菌为食的苍蝇中观察到类似的结果，其中转移，转移后和清除的苍蝇显示CFU显着减少，但洗涤没有可测量的效果，这表明CFU的减少是由于细菌从肠道而不是角质层中清除。与传统方法相比，每个点有2至25个菌落的点的CFU计数没有差异。
平均35个菌落的斑点显示CFU低于对照扩散板。这种减少可能是由于菌落在密集点重叠。在平板照片中，菌落强度比背景高300%。
植物乳杆菌m樱桃阳性菌落的红色强度比m樱桃阴性菌落高1， 000%。印度尼西亚醋杆菌GFP阳性菌落的绿色强度比GFP阴性菌落高200%。ImageJ的Count-On-It插件自动从盘子照片中计数CFU。
准确检测菌落，计数与手动计数相当。盘点收据可用于识别错误盘点。改变大小阈值和荧光波长允许分别计数不同的菌落形态。
在串珠之前，必须确保板密封良好。设计积极的对照来校准您的测量值也很重要。我们还使用这种技术在体外研究96孔板中的细菌种群，这使我们能够研究混合细菌群落。
该技术允许高通量筛选方法来测量肠道定植以及定植中的生物学变异。
