ספירת יחידות יוצרות מושבה, או CFUs, היא טכניקה סטנדרטית במיקרוביולוגיה, אך היא איטית והיא דורשת הרבה צלחות אגר. הטכניקה שלנו מספקת יתרון של פי מאה על פני שיטות ספירת CFU מסורתיות בשתי צלחות אגר הזמן. יישמנו את המתודולוגיה כדי למדוד את מיקרוביום המעיים של מודלים של בעלי חיים קטנים, במיוחד זבובי פירות.
פרוטוקול זה הוא דרך פשוטה, מהירה ואוטומטית לכמת CFUs בזבובי גנוטוביוטיקה. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה עם מכשור מפוברק DIY לצילום יחידות ה- CFU ותוכנה מותאמת אישית כדי להפוך את הספירה לאוטומטית. פרוטוקול זה יכול לשמש בכל ניסוי מיקרוביולוגי שבו שיטות יעילות יותר של ציפוי וספירת CFU יכולות להיות שימושיות.
טיפול יעיל בזבובים ואיתור הצלחות דורשים מיומנות ידנית, ולכן יש לתרגל זאת. השימוש בתוכנת הספירה האוטומטית דורש שיקול דעת לגבי הסף, ולכן יש להשוות את הקבלות לספירות ידניות כדי לזהות את הפרמטרים הטובים ביותר לניסוי שלך הדגמת ההליך יהיה רן דודג', חוקר מהמעבדה שלי שפיתח את הטכניקה. כדי להתחיל, מוזגים חרוזי זכוכית בגודל 0.5 מיקרון על מגש מדידת החרוזים.
מורחים את החרוזים על המגש כך שכל הבארות יהיו מלאות ומפולסות. לאחר מכן, הברישו את החרוזים העודפים לתוך צינור חרוטי. כעת, הניחו צלחת PCR חצי-חצאית הפוכה על מגש המדידה והתאימו אותה לבארות על ידי התאמתה לכניסה במגש המדידה.
לאחר מכן, הפוך אותו במהירות כדי להעביר את החרוזים. הסר חרוזים עודפים ממשטח צלחת ה- PCR. ודא שכל הבארות מכילות חרוזים.
במידת הצורך, השתמשו בכף מדידה כדי להוסיף חרוזים לבאר אחת. לאחר מכן, לכסות את הצלחת עם רדיד אלומיניום autoclave. לפני השימוש בצלחת, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS לכל באר מיד לפני הוספת הזבובים באמצעות פייפטר 96 ערוצים.
לעיקור פני השטח של הזבובים המורמים, העבירו זבובים מהבקבוקון לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר באמצעות משפך קטן. מיד לרסס מיליליטר אחד של 70% אתנול לתוך הצינור, לסגור את הצינור, ולערבב על ידי היפוך במשך 10 שניות. לאחר מכן, שאפו את האתנול עם פיפטה P-1000 תוך הימנעות משאיפת זבובים.
לאחר שטיפת PBS סופית, סגרו את הצינור והקישו עליו בחוזקה על הספסל מספר פעמים כשצד הכובע כלפי מטה כדי שהזבובים ייכנסו לכובע. לאחר פתיחת הצינור, יש לטפטף זבובים לתוך הבארות באמצעות מלקחיים ולהניח זבוב אחד בכל באר. יש להרדים את הזבובים על ידי שמירת הצלחת על הקרח בזמן הטעינה.
הסר חרוזים תועים קרוב לבארות, שכן אלה יכולים לשבור את אטם נייר הכסף ולגרום לדליפה. ודאו שהצד העמום של רדיד האיטום מכוון כלפי מטה על הצלחת והצד המבריק פונה כלפי מעלה לכיוון אוטם החום. לחץ על איטום החום בחוזקה במשך חמש שניות ושרוף עם המוליך הידני כדי לאבטח את נייר הכסף.
הומוגניזציה של הזבובים במשך חמש דקות. ודא כי הזבובים הם הומוגניים לחלוטין ואת הפתרון הופך צבעוני. כדי להסיר נוזלים מנייר האיטום, סובבו את צלחת החרוזים למשך 30 שניות בספינר צלחת קטן ב-350 G.הסירו את נייר הכסף תוך כדי החזקת הצלחת כדי למנוע התזת טיפות של הומוגנט זבוב.
הניחו שלושה לוחות גידול מלבניים של MRS agar כשהמכסים שלהם פתוחים בארון הבטיחות הביולוגית לייבוש למשך 10 דקות לפחות. הכן שתי צלחות דילול על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של PBS לכל באר של צלחת סטרילית של 96 בארות באמצעות פייפטר של 96 ערוצים. טען מתלה של קצוות P-20 על הפייפטר בן 96 הערוצים.
בצע דילול של 1:10 על ידי שאיפת 11.1 מיקרוליטרים של הומוגנט מצלחת הדגימה. כעת, חלקו אותו לצלחת הדילול הראשונה המכילה 100 מיקרוליטרים של PBS סטרילי לכל באר. שמור את צלחת הדילול על שייקר הצלחת למשך 10 שניות במהירות של 600 סל"ד.
מערבבים שוב על ידי צנרת למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים. העבירו 11.1 מיקרוליטרים מצלחת הדילול הראשונה לצלחת הדילול השנייה וחזרו על שלבי הערבוב לכל דילול נוסף. עבור לוחות תצפית, טען שני מיקרוליטרים מכל באר לתוך pipeter 96 ערוצים.
הנמיכו את ראש הפיפטר באיטיות על הצלחת, תוך הימנעות מדקירה לתוך האגר, וודאו שכל הכתמים חולקו. לאחר מכן, בדוק כי כתמים נוזליים במהירות לספוג לתוך אגר ולא לרוץ יחד. חזור על תהליך הציפוי עבור לוחות הדילול הנותרים כמתואר בכתב היד.
לאחר שהנוזל נספג לחלוטין באגר, הפכו את הלוחות ודגרו אותם עד שהמושבות הגיעו לגודל אופטימלי. ארגנו את הצלחות בצורה הגיונית ושמרו אותן בסדר מסוים בזמן הצילום. כוון אותם כך ש- A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה עבור כל הלוחות.
לאחר הסרת מכסה הצלחת, הניחו את הצלחת על הבמה עם כיוון A1 בפינה הנכונה. דמיינו את הלוחות. העבר את התמונות למחשב ושנה את שמותיהן, כולל שם הניסוי, סוג המדיה, גורם הדילול ופרטים רלוונטיים אחרים.
ארגנו את התמונות שיעובדו לכימות בתיקייה. שמות הקבצים המבדילים בין הלוחות הופכים לכותרות עמודות עבור כל קבוצת ספירות בגיליון האלקטרוני של הפלט. צור תיקיות משנה בשם 'חתוך' ו'קבלות' בתיקיה.
תיקיות אלה יקבלו את קבצי הפלט. כעת הפעל את תוסף Croptacular מ- ImageJ ולחץ על אישור כדי להתחיל לחתוך. תיבת דו-שיח לבחירת תיקיית המקור תופיע.
לחץ על OK. בחר את תיקיית המקור ולחץ על פתח. לאחר מכן, לחץ על אישור בתיבת הדו-שיח לבחירת ספריית היעד. בחר את תיקיית היעד ולחץ על פתח.
אם התמונה כבר ישרה, פשוט לחץ על רווח. אחרת, יישר את התמונה על-ידי ציור קו לאורך קצה שאמור להפוך לאופקי. ציירו מחדש את הקו כמה פעמים שצריך אם התמונה לא נראית ישרה.
לאחר מכן, ציירו תיבת גבול לאזור הספירה והתאימו את גודלו ופרופורציה שלו עד שכל הכתמים יהיו בתוך התאים שלהם. גרור את הסמן אל מחוץ לתיבת הגבול כדי לרענן את הרשת. כאשר הרשת נראית טוב, לחץ על רווח.
מכיוון שהתוסף מניח שכל התמונות מיושרות באופן זהה, ודא שהתמונה הבאה מסתובבת באופן אוטומטי לאותה זווית כמו התמונה הראשונה. אם זה מדויק, לחץ על רווח כדי להמשיך. אחרת, יישרו את התמונה כמו קודם.
הרשת גם נזכרת באותו מיקום כמו בתמונה הקודמת. התאם במידת הצורך ולחץ על רווח. הפעל את Count-On-It ובחר Gridiron.
קבעו את עוצמת מושבת הסף בהתבסס על ערך עוצמת פיקסלים עליון ותחתון. הפוך את הסף למחמיר ככל האפשר, תוך בחירת כל המושבות. לחץ/י על ״אישור״ בתיבת הדו-שיח ״פעולה נדרשת״ כאשר הסף משביע רצון ולאחר מכן לחץ/י על ״אישור״ כדי להמשיך.
בתמונה הראשונה, ניתנת האפשרות להמשיך או לחזור לתפריט ההתקנה. כדי להמשיך בתהליך האצווה, לחץ על אישור. לאחר מכן, בחר תיקיה כדי לשמור על טבלת הקבלות והתוצאות. השתמש בתיקיה 'קבלות' שנוצרה קודם לכן.
לאחר התמונה הראשונה, ברירת המחדל של התמונות הבאות תהיה באותו סף כמו ההגדרות הקודמות. לחץ על אישור כדי להשתמש בהגדרות אלה או להתאים את ההגדרות. סקור את קבלות הספירה המיוצרות על-ידי התוכנה ותקן באופן ידני שגיאות ספירה.
התוסף ImageJ מדויק סטטיסטית, אך מתרחשות שגיאות. הוכחת הקבלות כדי לבחון חריגות ולזהות טעויות בחשבונות. התוכנה שומרת את נתוני CFU כקובץ CSV באותה תיקיה כמו הקבלות.
עבור זבובים שהתיישבו עם לקטובצילוס פלנטרום, חלה ירידה משמעותית בחיידקים עבור זבובים שהועברו מדי יום למזון סטרילי, הועברו מדי יום, נשמרו על מזון סטרילי ארבע שעות לפני הניתוח, או הועברו מדי יום ונשמרו על אגר סטרילי ארבע שעות לפני הניתוח בהשוואה לזבובים שמעולם לא הועברו למזון סטרילי לאחר החיסון. תוצאות דומות נצפו בזבובים שניזונו מ-Acetobacter indonesiensis, שם זבובים שהועברו, הועברו ופונו הראו ירידה משמעותית ב-CFU, אך לשטיפה לא הייתה השפעה ניתנת למדידה, מה שמרמז על כך שהירידה ב-CFUs נבעה מסילוק חיידקים מהמעיים ולא מהקוטיקולה. ספירת CFU בנקודות עם 2 עד 25 מושבות לנקודה לא הראתה הבדל בהשוואה לשיטה המסורתית.
כתמים בממוצע של 35 מושבות הראו CFUs נמוכים יותר מאשר לוחות התפשטות הבקרה. ייתכן שהפחתה זו נובעת ממושבות החופפות בנקודות צפופות. בצילומי צלחת, עוצמת המושבה הייתה גבוהה ב-300% מהרקע.
המושבות החיוביות של לקטובצילוס פלנטרום mCherry הציגו עוצמה אדומה גבוהה ב-1, 000% בהשוואה למושבות שליליות ל-mCherry. מושבות חיוביות ל-GFP של Acetobacter indonesiensis הראו עוצמה ירוקה גבוהה ב-200% בהשוואה למושבות שליליות ל-GFP. תוסף Count-On-It עבור ImageJ הופך את ספירת CFU מתמונות הצלחת לאוטומטית.
מושבות מזוהות במדויק, עם ספירות דומות לספירה ידנית. ניתן להשתמש בקבלות ספירה כדי לזהות ספירות שגויות. שינוי ספי הגודל ואורכי הגל הפלואורסצנטיים מאפשר לספור מורפולוגיות מושבות שונות בנפרד.
חשוב לוודא שהצלחת אטומה היטב לפני חרוזים. חשוב גם לתכנן בקרות חיוביות כדי לכייל את המדידות. אנו משתמשים בטכניקה זו גם כדי לחקור אוכלוסיות של חיידקים במבחנה בלוחות של 96 בארות, מה שמאפשר לנו לחקור קהילות מעורבות של חיידקים.
טכניקה זו מאפשרת גישות לסינון תפוקה גבוהה למדידת התיישבות במעיים, כמו גם שונות ביולוגית בקולוניזציה.
