Das Zählen von koloniebildenden Einheiten oder CFUs ist eine Standardtechnik in der Mikrobiologie, aber es ist langsam und erfordert viele Agarplatten. Unsere Technik bietet einen hundertfachen Vorteil gegenüber herkömmlichen CFU-Zählmethoden in beiden Zeitagarplatten. Wir haben die Methodik angewendet, um das Darmmikrobiom von Kleintiermodellen, insbesondere Fruchtfliegen, zu messen.
Dieses Protokoll ist eine einfache, schnelle und automatisierte Methode zur Quantifizierung von CFUs in Gnotobiotika-Fliegen. Dieses Protokoll bietet einen Workflow mit DIY-gefertigten Instrumenten zum Fotografieren der CFUs und benutzerdefinierter Software, um sie zu zählen. Dieses Protokoll könnte in jedem mikrobiologischen Experiment verwendet werden, bei dem effizientere Methoden der Beschichtung und CFU-Zählung nützlich sein könnten.
Der effiziente Umgang mit den Fliegen und das Erkennen der Platten erfordern manuelle Geschicklichkeit, daher sollte dies geübt werden. Die Verwendung der automatisierten Zählsoftware erfordert eine Beurteilung des Schwellenwerts, daher sollten die Belege mit manuellen Zählungen verglichen werden, um die besten Parameter für Ihr Experiment zu ermitteln. Das Verfahren wird von Ren Dodge demonstriert, einem Forscher aus meinem Labor, der die Technik entwickelt hat. Gießen Sie zunächst 0,5-Mikron-Glasperlen auf die Perlenmessschale.
Verteilen Sie die Perlen auf dem Tablett, so dass alle Brunnen voll und nivelliert sind. Dann überschüssige Perlen in ein konisches Röhrchen bürsten. Legen Sie nun eine halbumrissene PCR-Platte kopfüber auf die Messschale und richten Sie sie mit den Vertiefungen aus, indem Sie sie in die Vertiefung auf der Messschale einpassen.
Drehen Sie es dann schnell um, um die Perlen zu übertragen. Entfernen Sie überschüssige Perlen von der PCR-Plattenoberfläche. Stellen Sie sicher, dass alle Vertiefungen Perlen enthalten.
Verwenden Sie bei Bedarf eine Wiegeschaufel, um Perlen zu einem einzelnen Vertiefung hinzuzufügen. Dann bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie und Autoklav. Bevor Sie die Platte verwenden, fügen Sie 100 Mikroliter PBS zu jeder Vertiefung hinzu, unmittelbar bevor Sie die Fliegen mit dem 96-Kanal-Pipetter hinzufügen.
Zur Oberflächensterilisation der anästhesierten Fliegen werden die Fliegen aus dem Fläschchen mit einem kleinen Trichter in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Sprühen Sie sofort einen Milliliter 70% Ethanol in das Röhrchen, schließen Sie das Röhrchen und mischen Sie es durch Inversion für 10 Sekunden. Dann saugen Sie das Ethanol mit einer P-1000-Pipette ab, während Sie vermeiden, Fliegen anzusaugen.
Nach dem letzten PBS-Waschen schließen Sie die Tube und klopfen Sie sie einige Male mit der Kappenseite nach unten fest auf die Bank, damit die Fliegen in die Kappe gehen. Nach dem Öffnen des Röhrchens die Fliegen mit einer Pinzette in die Vertiefungen dosieren und eine Fliege in jede Vertiefung legen. Halten Sie die Fliegen betäubt, indem Sie die Platte während des Beladens auf Eis halten.
Entfernen Sie verirrte Perlen in der Nähe der Vertiefungen, da diese die Foliendichtung brechen und Leckagen verursachen können. Stellen Sie sicher, dass die stumpfe Seite der Siegelfolie auf der Platte nach unten ausgerichtet ist und die glänzende Seite nach oben zum Heißsiegelgerät zeigt. Drücken Sie den Heißsiegeler fünf Sekunden lang fest und brünieren Sie ihn mit dem Handapplikator, um die Folie zu sichern.
Homogenisieren Sie die Fliegen für fünf Minuten. Stellen Sie sicher, dass die Fliegen vollständig homogenisiert sind und die Lösung gefärbt wird. Um Flüssigkeit aus der Dichtungsfolie zu entfernen, drehen Sie die Perlenplatte 30 Sekunden lang in einem Miniplattenspinner bei 350 G.Entfernen Sie die Folie, während Sie die Platte halten, um Spritztropfen von Fliegenhomogenat zu vermeiden.
Legen Sie drei rechteckige MRS-Agar-Wachstumsplatten mit geöffneten Deckeln in den Biosicherheitswerkbänke, um mindestens 10 Minuten lang zu trocknen. Bereiten Sie zwei Verdünnungsplatten vor, indem Sie 100 Mikroliter PBS in jede Vertiefung einer sterilen 96-Well-Platte mit einem 96-Kanal-Pipetter geben. Legen Sie ein Rack mit P-20-Spitzen auf den 96-Kanal-Pipetter.
Machen Sie eine Verdünnung von 1:10, indem Sie 11,1 Mikroliter Homogenat aus der Probenplatte absaugen. Geben Sie es nun in die erste Verdünnungsplatte, die 100 Mikroliter steriles PBS pro Vertiefung enthält. Halten Sie die Verdünnungsplatte 10 Sekunden lang auf dem Plattenschüttler bei 600 U/min.
Mischen Sie erneut, indem Sie mindestens 10 Mal auf und ab pipettieren. 11,1 Mikroliter von der ersten Verdünnungsplatte auf die zweite Verdünnungsplatte überführen und die Mischschritte für alle weiteren Verdünnungen wiederholen. Für Spotting-Platten laden Sie zwei Mikroliter aus jeder Vertiefung in den 96-Kanal-Pipetter.
Senken Sie den Pipeterkopf langsam auf die Platte, vermeiden Sie ein Stechen in den Agar, und stellen Sie sicher, dass alle Stellen abgegeben wurden. Überprüfen Sie dann, ob die flüssigen Stellen schnell in den Agar eindringen und nicht zusammen laufen. Wiederholen Sie den Plattierungsvorgang für die verbleibenden Verdünnungsplatten, wie im Manuskript beschrieben.
Sobald die Flüssigkeit vollständig in das Agar absorbiert wurde, kehren Sie die Platten um und brüten Sie sie, bis die Kolonien die optimale Größe erreicht haben. Organisieren Sie die Platten logisch und halten Sie sie beim Fotografieren in einer bestimmten Reihenfolge. Richten Sie sie so aus, dass sich A1 in der oberen linken Ecke für alle Platten befindet.
Nachdem Sie den Plattendeckel entfernt haben, legen Sie die Platte auf die Bühne, wobei A1 in der richtigen Ecke ausgerichtet ist. Stellen Sie sich die Platten vor. Übertragen Sie die Bilder auf einen Computer und benennen Sie sie um, einschließlich des Experimentnamens, des Medientyps, des Verdünnungsfaktors und anderer relevanter Details.
Organisieren Sie die zur Quantifizierung zu verarbeitenden Bilder in einem Ordner. Die Dateinamen, die die Platten unterscheiden, werden zu Spaltentiteln für jeden Zählsatz in der Ausgabetabelle. Erstellen Sie Unterordner mit den Namen Cropped und Receipts im Ordner.
Diese Ordner erhalten die Ausgabedateien. Starten Sie nun das Croptacular Plugin von ImageJ und klicken Sie auf OK, um mit dem Zuschneiden zu beginnen. Ein Dialogfeld zur Auswahl des Quellordners wird angezeigt.
Klicken Sie auf OK. Wählen Sie den Quellordner aus und klicken Sie auf Öffnen. Klicken Sie dann im Dialogfeld zum Auswählen des Zielverzeichnisses auf OK. Wählen Sie den Zielordner aus und klicken Sie auf Öffnen.
Wenn das Bild bereits gerade ist, drücken Sie einfach die Leertaste. Andernfalls richten Sie das Bild aus, indem Sie eine Linie entlang einer Kante zeichnen, die horizontal werden soll. Zeichnen Sie die Linie so oft wie nötig neu, wenn das Bild nicht gerade erscheint.
Zeichnen Sie als Nächstes ein Begrenzungsfeld für den Zählbereich und passen Sie dessen Größe und Proportion an, bis sich alle Punkte in ihren Zellen befinden. Ziehen Sie den Cursor aus dem Begrenzungsfeld heraus, um das Raster zu aktualisieren. Wenn das Raster gut aussieht, drücken Sie die LEERTASTE.
Da das Plugin davon ausgeht, dass alle Fotos identisch ausgerichtet sind, stellen Sie sicher, dass das nächste Bild automatisch in den gleichen Winkel gedreht wird wie das erste. Wenn dies korrekt ist, drücken Sie die LEERTASTE, um fortzufahren. Andernfalls richten Sie das Bild wie zuvor aus.
Das Raster erinnert sich auch an die gleiche Position wie das vorherige Bild. Passen Sie ggf. an und drücken Sie die Leertaste. Starten Sie Count-On-It und wählen Sie Gridiron.
Legen Sie die Intensität der Schwellenwertkolonie basierend auf einem oberen und einem unteren Pixelintensitätswert fest. Machen Sie die Schwelle so streng wie möglich, während Sie immer noch alle Kolonien auswählen. Klicken Sie im Dialogfeld Aktion erforderlich auf OK, wenn der Schwellenwert zufriedenstellend ist, und klicken Sie dann auf OK, um fortzufahren.
Auf dem ersten Bild wird die Option gegeben, fortzufahren oder zum Setup-Menü zurückzukehren. Klicken Sie auf OK, um mit dem Stapelvorgang fortzufahren. Wählen Sie dann einen Ordner aus, in dem die Belege und die Ergebnistabelle gespeichert werden sollen. Verwenden Sie den zuvor erstellten Ordner Receipts.
Nach dem ersten Bild haben die folgenden Bilder standardmäßig denselben Schwellenwert wie die vorherigen Einstellungen. Klicken Sie auf OK, um diese Einstellungen zu verwenden oder die Einstellungen anzupassen. Überprüfen Sie die von der Software erzeugten Zählbelege und korrigieren Sie manuell alle Zählfehler.
Das ImageJ-Plugin ist statistisch korrekt, aber es treten Fehler auf. Prüfen Sie die Quittungen, um Ausreißer zu untersuchen und Fehlzählungen zu identifizieren. Die Software speichert die CFU-Daten als CSV-Datei im selben Ordner wie die Belege.
Bei Fliegen, die mit Lactobacillus plantarum besiedelt waren, gab es eine signifikante Abnahme der Bakterien für Fliegen, die entweder täglich auf steriles Futter übertragen, täglich übertragen, vier Stunden vor der Analyse auf steriles Futter gehalten oder täglich übertragen und vier Stunden vor der Analyse auf sterilem Agar gehalten wurden, verglichen mit Fliegen, die nach der Impfung nie auf steriles Futter übertragen wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Acetobacter indonesiensis-gefütterten Fliegen beobachtet, wo transferierte, nachtransferierte und geklärte Fliegen eine signifikante Reduktion der CFUs zeigten, aber das Waschen hatte keinen messbaren Effekt, was darauf hindeutet, dass die Verringerung der KBE auf die Beseitigung von Bakterien aus dem Darm und nicht aus der Nagelhaut zurückzuführen war. Die KBE-Zählung in Spots mit 2 bis 25 Kolonien pro Spot zeigte keinen Unterschied im Vergleich zur traditionellen Methode.
Flecken mit durchschnittlich 35 Kolonien zeigten niedrigere KBE als die Kontrollstreuplatten. Diese Verringerung könnte darauf zurückzuführen sein, dass sich Kolonien an dichten Stellen überlappen. Auf Plattenfotos war die Kolonieintensität 300% höher als der Hintergrund.
Die mCherry-positiven Kolonien von Lactobacillus plantarum zeigten eine um 1.000% höhere Rotintensität als mCherry-negative Kolonien. Acetobacter indonesiensis GFP-positive Kolonien zeigten eine 200% höhere grüne Intensität als GFP-negative Kolonien. Das Count-On-It-Plugin für ImageJ automatisiert die CFU-Zählung aus den Plattenfotos.
Kolonien werden genau erkannt, mit vergleichbaren Zählungen wie bei manueller Zählung. Zählbelege können verwendet werden, um Fehlzählungen zu identifizieren. Durch die Änderung von Größenschwellen und Fluoreszenzwellenlängen können verschiedene Koloniemorphologien separat gezählt werden.
Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Platte vor dem Abperlen gut versiegelt ist. Es ist auch wichtig, Positivkontrollen zu entwerfen, um Ihre Messungen zu kalibrieren. Wir verwenden diese Technik auch, um In-vitro-Populationen von Bakterien in 96-Well-Platten zu untersuchen, wodurch wir gemischte Bakteriengemeinschaften untersuchen können.
Diese Technik ermöglicht Hochdurchsatz-Screening-Ansätze, um die Darmbesiedlung sowie die biologische Variation in der Kolonisation zu messen.
